[發(fā)明專利]一種熒光法耐藥微生物的篩選方法

在審

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• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113897412A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林文芳;崔麗;楊凱;朱永官
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院城市環(huán)境研究所
• 主分類號: C12Q1/10
• 分類號: C12Q1/10;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種熒光法耐藥微生物的篩選方法，包括：將微生物在含有抗生素以及疊氮或炔基基團的氨基酸的第一培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一預(yù)定時間；將經(jīng)所述第一培養(yǎng)物培養(yǎng)的所述微生物轉(zhuǎn)移至含有炔基或疊氮基團的熒光染料的反應(yīng)液中反應(yīng)第二預(yù)定時間；對經(jīng)過所述反應(yīng)液培養(yǎng)的微生物進行熒光檢測，且確定具有熒光信號的微生物為耐藥微生物。本發(fā)明提供了一種快速檢測耐藥微生物的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種耐藥微生物的篩選方法。

背景技術(shù)

抗菌藥物如抗生素是人類歷史上最偉大的發(fā)明之一，它有效控制了細菌感染，挽救了數(shù)以億級的生命。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)，抗菌藥物的使用也大大提高了家畜的存活率，保障了農(nóng)戶的收益。然而抗菌藥物尤其是抗生素的濫用和錯用卻大大提高了環(huán)境中細菌的耐藥性，導致細菌感染無法有效治愈，目前已在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)了對多種抗生素等藥物的“超級細菌”，嚴重威脅了人類、動物和環(huán)境的健康，更為嚴重的是，耐藥基因可以借助可移動遺傳元件，如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子、病毒等，通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等方式將耐藥基因橫向轉(zhuǎn)移至其它菌株，使其它菌株產(chǎn)生耐藥性，甚至促進多重耐藥菌的產(chǎn)生和蔓延，加速了耐藥性的傳播。另外，環(huán)境中殘留的各種抑菌和殺菌類抗菌藥物，如抗生素、防腐劑、重金屬，消毒副產(chǎn)物，甚至抗癌和抗抑郁藥物，可通過共選擇的途徑促進耐藥基因突變，誘導細菌產(chǎn)生耐藥性。產(chǎn)生的耐藥性還可進一步通過垂直轉(zhuǎn)移在子代細菌中穩(wěn)定遺傳，導致具有耐藥性的細菌不斷增加。目前，耐藥菌和耐藥傳播已成為全球最嚴峻的公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織提出了“遏制耐藥-今天不采取行動，明天就無藥可用”的呼吁。因此，發(fā)展檢測耐藥菌和耐藥傳播和產(chǎn)生的方法，對于發(fā)展有效策略，積極遏制耐藥產(chǎn)生和傳播，保障全球的公共衛(wèi)生和人類健康具有重大意義。然而，目前對耐藥菌和耐藥性傳播和產(chǎn)生的檢測，仍然缺乏快速、靈敏、精準和普適的方法。

現(xiàn)有技術(shù)用于檢測和識別環(huán)境耐藥菌的方法，主要是基于純培養(yǎng)和分子檢測技術(shù)。然而，純培養(yǎng)方法只能用于檢測可培養(yǎng)的微生物，而對于環(huán)境樣品中絕大部分(＞99％)的不可培養(yǎng)微生物無計可施，且費時費力。分子檢測技術(shù)則通過提取微生物總的基因組，然后檢測抗性基因的有無或進行定量，該方法檢測總的抗性基因包含死的耐藥菌攜帶的抗性基因及不表達的抗性基因，因此造成耐藥菌的大大高估。

因此，現(xiàn)有技術(shù)缺少一種能夠快速進行耐藥菌篩選的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述方法存在的問題至少之一，本發(fā)明提供一種熒光法耐藥微生物的篩選方法

包括：

一種熒光法耐藥微生物的篩選方法，包括：

將微生物在含有抗生素以及疊氮和/或炔基基團的氨基酸，如HPG(L-型高炔丙基甘氨酸)的第一培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一預(yù)定時間；

將經(jīng)所述第一培養(yǎng)物培養(yǎng)的所述微生物轉(zhuǎn)移至含有炔基/疊氮基團的熒光染料，如FAM(羧基熒光素)疊氮熒光染料的反應(yīng)液中反應(yīng)第二預(yù)定時間；

對經(jīng)過所述反應(yīng)液反應(yīng)后的微生物進行熒光檢測，且確定具有熒光信號的微生物為耐藥微生物。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，HPG可被微生物，如大腸桿菌進行同化，同化后的細胞與FAM反應(yīng)后即可被熒光檢測裝置檢測獲得熒光；基于此，對于敏感菌而言，其被抗生素抑制后無法同化HPG，而耐藥菌則可以正常同化HPG，因此，通過熒光檢測的有無即可進行耐藥菌的篩選，簡化了耐藥菌的篩選過程。

可選的，所述將微生物在含有抗生素以及HPG的第一培養(yǎng)物中培養(yǎng)第一預(yù)定時間，包括：

第一培養(yǎng)物的配制，所述第一培養(yǎng)物包括不含甲硫氨酸的M9無機鹽培養(yǎng)基；

將所述微生物轉(zhuǎn)移至所述第一培養(yǎng)物中，并進行HPG標記。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，不含甲硫氨酸的M9無機鹽培養(yǎng)基能夠最大限度的降低對微生物對HPG同化的影響，從而保證結(jié)果的準確。