[發明專利]一種熒光法耐藥微生物的篩選方法

在審

• 申請號: 202111113028.2
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113897412A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 林文芳;崔麗;楊凱;朱永官
• 申請（專利權）人: 中國科學院城市環境研究所
• 主分類號: C12Q1/10
• 分類號: C12Q1/10;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于，包括：

將微生物在含有抗生素以及疊氮和/或炔基基團的氨基酸的第一培養物中培養第一預定時間；

將經所述第一培養物培養的所述微生物轉移至含有炔基和/或疊氮基團的熒光染料的反應液中反應第二預定時間；

對經過所述反應后獲得的微生物進行熒光檢測，且確定具有熒光信號的微生物為耐藥微生物。

2.根據權利要求1所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：

所述疊氮和/或炔基基團的氨基酸包括HPG，所述將微生物在含有抗生素以及疊氮和/或炔基基團的氨基酸的第一培養物中培養第一預定時間，包括：

第一培養物的配制，所述第一培養物包括不含甲硫氨酸的M9無機鹽培養基；

將所述微生物轉移至所述第一培養物中，并進行HPG標記。

3.根據權利要求2所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：

所述將微生物在含有抗生素以及HPG的第一培養物中培養第一預定時間，還包括：

將所述微生物在所述M9無機鹽培養基中進行預培養以獲得代謝活性較高的高活性微生物，采用所述高活性微生物進行HPG標記實驗。

4.根據權利要求3所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：

所述HPG標記實驗，包括：

將所述高活性微生物轉接至新鮮的所述M9無機鹽培養基中，并在所述高活性微生物的不同生長周期添加HPG進行標記，和/或，在所述高活性微生物的同一生長周期添加HPG進行不同時長的標記，對經標記后的所述高活性微生物進行熒光檢測，確定熒光信號最強的條件為最佳標記條件；

所述將所述微生物轉移至所述第一培養物中，并進行HPG標記，包括，在所述最佳標記條件下進行所述HPG標記。

5.根據權利要求4所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：

所述將微生物在含有抗生素以及HPG的第一培養物中培養第一預定時間，還包括：

所述抗生素的濃度由所述微生物的種類確定，且所述抗生素的添加時間早于所述HPG的添加時間。

6.根據權利要求2所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：

所述炔基和/或疊氮基團包括FAM，所述將經所述第一培養物培養的所述微生物轉移至含有炔基和/或疊氮基團的熒光染料的反應液中反應第二預定時間，包括：

細胞固定過程，所述細胞固定過程包括將所述微生物置于固定液中用于提高所述微生物細胞膜通透性。

7.根據權利要求6所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：所述固定液的配置方法包括：

稱取3g優級純BSA，添加100mL的PBS溶液溶解以形成第一混合液；

用移液槍吸取500μL的TritonX-100，轉移至所述第一混合液中混勻以形成第二混合液；

稱取4g多聚甲醛，加入100mL的所述第一混合液溶液，在60℃加熱3h溶解后制得。

8.根據權利要求6或7所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：將經所述第一培養物培養的所述微生物轉移至含有炔基和/或疊氮基團的熒光染料的反應液中反應第二預定時間，還包括：

將所述微生物轉移至所述所述反應液中，經避光反應第二預定時間后，將反應混合物離心，并用緩沖液沖洗后形成供熒光檢測的所述微生物。

9.根據權利要求1所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：所述熒光檢測包括流式細胞儀檢測和/或熒光顯微鏡檢測。

10.根據權利要求1所述的熒光法耐藥微生物的篩選方法，其特征在于：所述微生物包括大腸桿菌，所述抗生素包括氨芐青霉素、卡那霉素、及四環素中的一種或多種。