[發明專利]用于肺炎支原體檢測的核酸片段、引物探針組、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202111112375.3
• 申請日: 2021-09-18
• 公開（公告）號: CN113930529B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 李春明;朱兆奎;孔君堯
• 申請（專利權）人: 上海伯杰醫療科技股份有限公司北京分公司;上海伯杰醫療科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12N15/31;C12R1/35
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體涉及用于肺炎支原體檢測的核酸片段、引物探針組、試劑盒及其應用。本發明提供的針對肺炎支原體的特異性引物探針組、試劑盒的靈敏度及特異性均較好，能夠特異性地檢測肺炎支原體，檢測限可達100copies/mL，對于低濃度樣本的檢測靈敏度明顯更高，且具有操作簡單、檢測時間短的優勢，具有較好的應用前景。

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體涉及用于肺炎支原體檢測的核酸片段、引物探針組、試劑盒及其應用。

背景技術

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae，MP)是大小介于細菌和病毒之間的一種病原微生物，主要通過飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播，于1962年首次分離和培養。MP感染不僅引起肺部疾病，還能侵犯心、腦、肝、腎等其他器官，已成為小兒肺炎的重要病原體。在社區獲得性肺炎(CAP)中MP是重要病原，尤其在5歲以上兒童中，MP在非流行年占CAP病原的10～20％。此外，因MP生長緩慢、潛伏期及帶菌時間長，極易形成間歇期發病、長時期傳播的流行特點。由于MP感染常無特異性臨床表現，很容易與一般的病毒性感冒相混淆，因此MP感染需要及時確診，做到早發現早治療，減少兒童急性肺炎病情惡化，這其中早期診斷極為重要。

目前，肺炎支原體的檢測方法主要分為以下3種：

1、病原體分離培養法：用咽拭子、痰液、胸腔積液、肺泡灌洗液等進行體外肺炎支原體分離培養，是診斷MP感染最可靠的方法，是微生物檢測的“金標準”。但是MP分離培養需3至4周，且靈敏度低，耗時長，費力，技術要求高，不能滿足快速診斷的需求，從而限制了其臨床應用。

2、血清學檢測：血清學檢測方法較多，分為以下幾種：

(1)ELISA：ELISA法可用于檢測患者急性期和恢復期血清中特異性IgM、IgG抗體，該方法特異性高、快速經濟，是目前診斷支原體感染的可靠方法之一，但靈敏度低，容易出現假陰性。

(2)補體結合試驗：補體結合抗體在MP感染后7至9小時開始上升，3至4周達高峰。該方法靈敏度和特異性都較高，缺點為主要檢測IgM抗體，易受機體免疫系統的影響而出現假陰性，多用于早期診斷。

(3)間接血凝試驗：試驗原理與補體結合試驗相似，但靈敏度高于補體結合試驗。在肺炎支原體感染后7小時即可呈現陽性，10至30小時達到高峰。缺點為特異性較差。

(4)冷凝集試驗：人體感染MP后，血清中除了出現特異性抗體外還存在冷凝素，患者的稀釋血清與O型紅細胞在4℃條件下可發生凝集，此為IgM抗體，抗體效價越高或雙份血清呈4倍以上升高，提示受檢者近期MP感染的可能性越大，但該檢測無特異性。冷凝集試驗是診斷MP感染的傳統方法，其靈敏度和特異性均不理想。

3、分子生物學檢測：PCR是目前直接病原體檢測的首選方法，這些技術包括實時PCR、巢式PCR、多重PCR、熔解曲線等。此外，還有等溫擴增技術，包括SAT、LAMP等。PCR方法具有快速、靈敏、特異性強等特點，大大地提高了檢測效率。熒光PCR技術是基于傳統PCR技術并結合光譜技術而發展起來的一種更靈敏、更特異、更精確的核酸檢測技術。檢測結果準確，重復性高，且整個過程中避免了傳統PCR需后處理的問題，減少了污染。但是目前，針對MP鑒定的基因片段的選擇和引物探針的設計存在特異性較低，與解脲脲原體、衣原體等存在交叉；部分檢測試劑盒的靈敏度偏低，易造成部分樣本漏檢；還有些檢測試劑存在無內參對照、或為外源性內參等問題；此外配套的檢測體系成分復雜，不僅靈敏度低，且操作復雜，導致多數檢測試劑無法實現準確、快速、靈敏的檢測，這些都為肺炎支原體的檢測帶來了不便。