[發明專利]一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202111110870.0
• 申請日: 2021-09-23
• 公開（公告）號: CN113621559A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 王瑩;郭振玉;張弛;楊海明
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 許必元

本發明涉及一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，該培養方案步驟如下：選擇肉鴿，頸部放血處死，75%酒精擦拭消毒取出卵巢，收集4?6mm卵泡；剝離卵泡外層血管和結蹄組織；固定卵泡后劃開，將卵泡膜層翻轉，分離出顆粒細胞層，洗凈卵黃；Ⅱ型膠原酶消化，過篩，M199培養基清洗后，離心棄上清；加入含胎牛血清的培養基，重懸顆粒細胞，測定細胞密度；接種至細胞培養皿中，置于培養箱中培養，得到肉鴿小黃卵泡顆粒細胞。本發明的方法不僅適用于小黃卵泡顆粒細胞層分離培養也適用于等級卵泡中顆粒細胞的分離培養；獲得的顆粒細胞純度高、細胞形態正常、活性好，培養方法易操作、重復性強。

技術領域

本發明涉及一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，屬于生物技術領域。

背景技術

隨著畜牧業結構調整，我國肉鴿存欄量不斷增加。2019年肉鴿存欄數突破5000萬對，肉鴿養殖業已成為特禽養殖業龍頭產業。隨著人們對蛋肉類食品營養要求的提高，對鴿產品的消費不斷增加。鴿屬晚成鳥、刺激性排卵，配對后產兩枚蛋即開始孵化，鴿的繁殖周期長、產蛋效率低使其不能滿足市場需求，嚴重制約了養鴿業的發展。促進卵泡發育、縮短產蛋間隔是提高肉鴿產蛋效率的重要手段。肉鴿的卵泡發育是一個連續變化的過程，高產的肉鴿的卵泡豐富、而低產肉鴿的卵泡發育不良，卵泡的發育率的降低將導致其產蛋量的減少。卵泡中的卵母細胞主要由外層的膜細胞和內層的顆粒細胞所包圍，顆粒細胞在卵泡成熟過程中，開始具備合成孕酮的能力。顆粒細胞由未分化狀態向分化狀態的轉變與卵泡的選擇直接相關，卵泡的生存能力在很大程度上歸因于顆粒細胞層對凋亡的獲得性抵抗，顆粒細胞調控卵泡的選擇過程。在肉鴿的卵泡發育過程中，僅有少數等級前卵泡能發育成優勢卵泡，而大多數的卵泡則是在不同時期發生閉鎖。一般情況下，顆粒細胞先發生凋亡，隨后卵母細胞退化死亡，導致卵泡閉鎖。顆粒細胞在卵泡的發育和閉鎖的過程中起決定性作用，進而影響肉鴿產蛋量。建立肉鴿原代顆粒細胞的體外培養模型為探究肉鴿卵泡發育和閉鎖機制提供理論基礎。肉鴿在一個產蛋期僅產2枚蛋，其卵泡發育機理不同于其他家禽，關于肉鴿顆粒細胞的培養方法還未見報道。本研究選擇直徑4-6mm卵泡分離顆粒細胞，進行顆粒細胞原代培養，為研究肉鴿卵泡發育和成熟提供基礎，為提高肉鴿產蛋性能具有重要意義。

發明內容

本發明目的在于針對上述的不足之處，為了解決上述技術難點，為探究肉鴿卵泡發育的作用機理提供基礎，旨在建立肉鴿小黃卵泡顆粒細胞分離和體外培養的方法，為提高肉鴿產蛋性能提供研究基礎，提供一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法。

本發明的目的是這樣實現的：一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，包括以下步驟：

（1）選擇產蛋期肉鴿頸部放血處死，75%酒精擦拭腹部后打開腹腔，取出卵巢和卵泡，并將其迅速放入預冷的PBS中；

（2）將卵泡按照直徑大小分離，將4-6mm卵泡轉移至新的預冷的PBS中；

（3）用鑷子剝離卵泡外層的血管，固定卵泡，將卵泡輕輕劃開，迅速將膜層和顆粒細胞層翻出，擠出卵黃，分離顆粒細胞層；

（4）將收集的顆粒細胞層用PBS清洗3次；

（5）將顆粒細胞仔細剪碎，并轉移至50mL離心管中，離心棄上清；

（6）加入等體積膠原酶液，輕輕吹打后放入37℃水浴鍋15-20min；

（7）加入等體積預冷M199培養基終止消化；

（8）將消化細胞經過滅菌的篩網，移入15mL離心管中，離心棄上清；

（9）清洗2-3次，轉移至含胎牛血清的M199培養基的培養皿重懸，細胞計數，達到1.5×10⁶個/mL；

（10）將培養皿轉移至培養箱中培養；

（11）培養36h后，更換含胎牛血清的M199培養基，貼壁細胞為顆粒細胞。

步驟（5）中，剪碎的顆粒細胞轉移至50mL離心管中離心，離心溫度為4℃，轉速為1000rpm，離心時間為5min；