[發明專利]一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法在審
| 申請號： | 202111110870.0 | 申請日： | 2021-09-23 |
| 公開（公告）號： | CN113621559A | 公開（公告）日： | 2021-11-09 |
| 發明（設計）人： | 王瑩;郭振玉;張弛;楊海明 | 申請（專利權）人： | 揚州大學 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222 | 代理人： | 許必元 |
| 地址： | 225009 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 肉鴿 卵泡 顆粒 細胞 分離 培養 方法 | ||
1.一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，包括以下步驟：
（1）選擇產蛋期肉鴿頸部放血處死，75%酒精擦拭腹部后打開腹腔，取出卵巢和卵泡，并將其迅速放入預冷的PBS中；
（2）將卵泡按照直徑大小分離，將4-6mm卵泡轉移至新的預冷的PBS中；
（3）用鑷子剝離卵泡外層的血管，固定卵泡，將卵泡輕輕劃開，迅速將膜層和顆粒細胞層翻出，擠出卵黃，分離顆粒細胞層；
（4）將收集的顆粒細胞層用PBS清洗3次；
（5）將顆粒細胞仔細剪碎，并轉移至50mL離心管中，離心棄上清；
（6）加入等體積膠原酶液，輕輕吹打后放入37℃水浴鍋15-20min；
（7）加入等體積預冷M199培養基終止消化；
（8）將消化細胞經過滅菌的篩網，移入15mL離心管中，離心棄上清；
（9）清洗2-3次，轉移至含胎牛血清的M199培養基的培養皿中重懸，細胞計數，達到1.5×106個/mL；
（10）將培養皿轉移至培養箱中培養；
（11）培養36h后，更換含胎牛血清的M199培養基，貼壁細胞為顆粒細胞。
2.根據權利要求1所述的一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，步驟（5）中，剪碎的顆粒細胞轉移至50mL離心管中離心，離心溫度為4℃，轉速為1000rpm，離心時間為5min；
步驟（8）中，細胞移入15mL離心管中離心，離心溫度為4℃，轉速為1000rpm，離心時間為5min。
3.根據權利要求1所述的一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，步驟（6）中，37℃水浴中振蕩孵育15-20min，時間掌握以細胞消化情況為準。
4.根據權利要求1所述的一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，所述培養基為M199培養基中加入10%胎牛血清。
5.根據權利要求1所述的一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，所述消化酶為按質量百分含量0.1%Ⅱ型膠原酶溶于無血清M199配制而成，配制0.5%Ⅱ型膠原酶為儲存液。
6.根據權利要求1所述的一種肉鴿小黃卵泡顆粒細胞的分離培養方法，特征在于，所述篩網為100目不銹鋼過濾網。
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