[發(fā)明專利]ASB17在制備治療NLRP3炎癥小體相關(guān)炎癥性疾病藥物中的用途

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111109244.X
• 申請(qǐng)日: 2021-09-22
• 公開（公告）號(hào): CN113827709A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳建國;萬品;楊戈;譚巧茹;譚秋萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 佛山病原微生物研究院
• 主分類號(hào): A61K38/53
• 分類號(hào): A61K38/53;A61P37/02;G01N33/68;G01N33/58
• 代理公司: 北京金智普華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

1.一種ASB17在制備治療NLRP3炎癥小體相關(guān)炎癥性疾病藥物中的用途。

2.一種驗(yàn)證權(quán)利要求1所述用途中ASB17制備治療NLRP3炎癥小體相關(guān)炎癥性疾病藥物藥效的方法，其特征在于，所述驗(yàn)證ASB17制備治療NLRP3炎癥小體相關(guān)炎癥性疾病藥物藥效的方法包括以下步驟：

步驟一，蛋白質(zhì)免疫印跡、酵母雙雜交、免疫共沉淀以及免疫熒光；

步驟二，重建NLRP3炎癥小體激活；

步驟三，蛋白質(zhì)降解及泛素化實(shí)驗(yàn)；

步驟四，小鼠原代細(xì)胞(BMDCs和BMDMs)分離實(shí)驗(yàn)；

步驟五，LPS誘導(dǎo)小鼠敗血癥及Alum誘導(dǎo)小鼠腹腔炎。

3.如權(quán)利要求2所述的驗(yàn)證ASB17制備治療NLRP3炎癥小體相關(guān)炎癥性疾病藥物藥效的方法，其特征在于，步驟一中，所述蛋白質(zhì)免疫印跡、酵母雙雜交、免疫共沉淀以及免疫熒光，包括：

(1)蛋白質(zhì)免疫印跡

跑膠和轉(zhuǎn)膜完成后，取出NC膜，用含有5％脫脂牛奶的PBST(PBS+0.5％Tween)封閉45min；PBST洗三次，每次5min；一抗用PBST緩沖液稀釋后，，4℃孵育過夜；回收一抗，PBST洗3次，每次5min；加入用含有2％脫脂牛奶的PBST配制的二抗，室溫孵育45min；PBST洗3次，每次10min；顯色和曝光；

(2)酵母雙雜交；

1)首先將NLRP3的結(jié)構(gòu)域PYD克隆到pGBKT7載體上,通過測(cè)序確定克隆成功；

2)將pGBKT7-PYD轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母菌中，通過Western blot實(shí)驗(yàn)確定PYD能夠在酵母菌中表達(dá)；

3)檢測(cè)PYD蛋白的表達(dá)是否能夠引起報(bào)告基因的自激活以及對(duì)酵母菌本身有毒性；

4)將含有pGBKT7-PYD的Y2HGold酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)，與含有人cDNA文庫的Y187酵母菌進(jìn)行交配；

5)將交配的酵母菌涂布在60-70個(gè)含有DDO/X/A的150cm平板上進(jìn)行篩選,涂布完之后，放在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6)48h后，將平板上的藍(lán)斑圈出來，做好菌落編號(hào)，然后將藍(lán)斑菌落接種到含有QDO/X/A的平板上進(jìn)行更加嚴(yán)格的篩選，涂布完后，放在30℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；48h之后將平板上的藍(lán)斑圈出來，接種到含有QDO/A的酵母培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

7)三天后，按照試劑盒上說明書來提取酵母中的質(zhì)粒；

8)將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)中，然后涂布到含有Ampr抗性的LB固體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h；

9)拿出LB固體培養(yǎng)基，挑菌，接種到含有Ampr抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床中培養(yǎng)12-16h；

10)提取相應(yīng)細(xì)菌的質(zhì)粒，送去測(cè)序；

11)將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast，確定未知cDNA的基因名稱；cDNA的序列不在對(duì)應(yīng)基因的編碼區(qū)，或者cDNA序列移碼導(dǎo)致不編碼對(duì)應(yīng)基因的蛋白或者部分區(qū)域，這些cDNA結(jié)果都需要排除；

12)將得到的陽性cDNA與誘餌基因PYD分別轉(zhuǎn)化到酵母菌中進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn),兩種酵母菌進(jìn)行交配，然后再涂布到含有DDO/A/X和QDO/A/X的平板上，看酵母是否能在這些平板上生長；如果能夠生長同時(shí)變藍(lán)，進(jìn)一步說明篩選得到的cDNA的可靠性，否則反之。

(3)免疫共沉淀；

1)用1.5ml EP管收集待處理的細(xì)胞樣品，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入0.5ml～1ml RIPA裂解液和cocktail蛋白酶抑制劑；混勻后，將EP管放在冰上裂解20min；其中，所述RIPA裂解液的配方為0.05M Tris，0.001M EDTA，0.15M NaCl，1％NP-40，5％glycerol；pH 7.4；

2)通過超聲儀超聲破碎EP管中的細(xì)胞樣品，離心，4℃，12000rpm，15min；離心之后，取上清液體100μl作為對(duì)照，加入25μl 5x SDS Loading Buffer，沸水浴10min，樣品保存；把1.5ml EP管中剩余的上清液體900μl全部轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的EP管中做后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

3)取出protein A/G珠子，用RIPA裂解液把protein A/G珠子洗三次，將處理之后protein A/G珠子加入到含有上述EP管中，放在4℃翻轉(zhuǎn)搖床上預(yù)孵育2h；離心，4℃，2000rpm，1min，吸取上清，不要吸到protein A/G珠子，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中；

4)加入相對(duì)應(yīng)的1μg IP抗體，將EP管放在4℃翻轉(zhuǎn)搖床上孵育過夜；第二天，取出新的protein A/G珠子，用RIPA裂解液洗三次，將處理好的protein A/G珠子加入到上述1.5mlEP管中，在4℃翻轉(zhuǎn)搖床上孵育2h；離心，4℃，2000rpm，1min；

5)去掉上清液體，用RIPA洗脫液洗4～6次；將EP管放在離心機(jī)上離心，4℃，2000rpm，1min，吸干EP管中殘留的液體，不要吸到protein A/G珠子；在EP管中加入50μl 2x SDSLoading Buffer，沸水浴10min，離心后，樣品放在-20℃冰箱保存；其中，所述RIPA洗脫液的配方為0.05M Tris，0.001M EDTA，0.3M NaCl，1％NP-40，5％glycerol；pH 7.4。

(4)免疫熒光：

棄掉confocal皿培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗兩次；加入預(yù)冷的甲醇和丙酮混合液，甲醇：丙酮為1：1，4℃，靜置20min；用PBS洗三次，每次5min；用含有3％胎牛血清白蛋白BSA的PBS封閉細(xì)胞1h；用PBS洗三次，每次5min；一抗用含有3％胎牛血清白蛋白BSA的1x PBS稀釋，加入皿中，4℃冰箱孵育過夜；用PBS洗三次，每次10min；熒光二抗用含有10％胎牛血清白蛋白BSA的1x PBS緩沖液稀釋，室溫避光孵育45min；用PBS洗三次，每次10min；加入用甲醇配置的DAPI染液染核，37℃避光孵育5min；用PBS洗三次，每次10min；用激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行分析和處理。