[發明專利]含人源APP和PSEN1基因的細胞模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202111098027.5
• 申請日: 2021-09-18
• 公開（公告）號: CN113774029A
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 江斌;袁永明;高爽
• 申請（專利權）人: 江西中洪博元生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

本發明提供了含人源APP和PSEN1基因的細胞模型及其構建方法，本發明選用慢病毒轉染細胞，將人源的APP和PS1導入到CHO細胞中，可以得到穩定傳代的細胞系，而且由于慢病毒本身攜帶有綠色熒光蛋白基因，能讓細胞在熒光顯微鏡下發出綠色熒光信號，增加了細胞的可識別性，以此判斷細胞的外源基因穩定性。另外，攜帶有人源APP和PS1基因的細胞，能穩定分泌出Aβ1?42和Aβ1?40。模擬AD細胞的發病特癥而成為一個細胞篩選模型，用于高通量篩選能抑制Aβ1?42和Aβ1?40分泌的藥物。

技術領域

本發明屬于藥物篩選模型技術領域，涉及含人源APP和PSEN1基因的細胞模型及其構建方法。

背景技術

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種年齡相關的中樞神經系統變性疾病，是老年癡呆的最常見的原因。AD的發病機制十分復雜，至今尚未明確。目前主要有以下幾種假說：基因突變假說，β淀粉樣蛋白沉積假說，突觸功能障礙假說，Tau蛋白的過度磷酸化假說，興奮性毒性氨基酸和免疫炎癥假說等，β淀粉樣蛋白的級聯假說占主導地位。可溶性β淀粉酶(Aβ)的增多和Aβ過度沉積是AD的主要致病因素。該假說認為，β淀粉樣前體蛋白(amyloidβprotein precursor，APP)經β分泌酶、γ分泌酶剪切成Aβ釋放到細胞外，并且在細胞外蓄積、老化形成老年斑并可引發一系列AD病理癥狀的出現，這些病理過程又反過來加劇了β淀粉樣蛋白的生成和沉積，從而產生級聯效應，導致神經纖維纏結和神經元的丟失。

在研發AD藥物中，通常會選擇APP/PSEN1轉基因小鼠進行藥效分析和機理研究，但是轉基因鼠的費用相對昂貴，也不適合于大規模的篩選工作。

發明內容

針對上述技術問題，本發明的目的在于提供含人源APP和PSEN1基因的細胞模型及其構建方法。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

本發明提供了含人源APP和PSEN1基因的細胞模型，是通過利用慢病毒轉染CHO細胞而導入人APP和PSEN1基因序列構建而成的細胞系CHO-APP/PS1。

優選地，所述慢病毒為Lenti-APP/PS1-GFP。

更優選地，所述慢病毒的包裝系統為三質粒系統，組成為：pCMV-dR8，pMD2.G，pGPD；慢病毒的包裝細胞采用293T。

本發明還提供了含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，包括：

1)構建人APP(WT)/PSEN1(PS1,WT)雙基因全長序列過表達的慢病毒；

2)采用組成為：pCMV-dR8，pMD2.G，pGPD的三質粒系統作為慢病毒包裝系統，采用293T作為慢病毒的包裝細胞，轉染48h后，收集病毒上清，過濾，濃縮；

3)將目的細胞接種于12孔板，培養過夜；

4)棄去培養基并添加0.5mL polybrene培養基混合物，每孔加入對應病毒0.5mL，對照細胞孔用培養基替代病毒；繼續培養，慢病毒感染16h后，收集廢棄病毒液，更換1mL新鮮培養基繼續培養；

5)慢病毒感染48h后，通過熒光顯微鏡觀察GFP的表達效率，更換含puromycin的新鮮培養基，篩選穩轉細胞株，之后根據細胞狀態，每2-3天更換一次含有puromycin的新鮮培養基，直至沒有病毒感染的對照細胞被puromycin全部殺死，即得到穩轉細胞株；最后將細胞再進行一輪單克隆篩選，獲得目的細胞系CHO-APP/PS1。

優選地，步驟1)包括：根據人APP(WT)/PS1(WT)雙基因全長序列及慢病毒載體序列設計并合成引物，合成引物序列如下：

APP-F：CCTCCATAGAAGATTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCACT，