[發明專利]含人源APP和PSEN1基因的細胞模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202111098027.5
• 申請日: 2021-09-18
• 公開（公告）號: CN113774029A
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 江斌;袁永明;高爽
• 申請（專利權）人: 江西中洪博元生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 劉召民

1.含人源APP和PSEN1基因的細胞模型，是通過利用慢病毒轉染CHO細胞而導入人APP和PSEN1基因序列構建而成的細胞系CHO-APP/PS1。

2.根據權利要求1所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型，其特征在于，所述慢病毒為Lenti-APP/PS1-GFP。

3.根據權利要求1所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型，其特征在于，所述慢病毒的包裝系統為三質粒系統，組成為：pCMV-dR8，pMD2.G，pGPD；慢病毒的包裝細胞采用293T。

4.含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，包括：

1)構建人APP(WT)/PSEN1(PS1,WT)雙基因全長序列過表達的慢病毒；

2)采用組成為：pCMV-dR8，pMD2.G，pGPD的三質粒系統作為慢病毒包裝系統，采用293T作為慢病毒的包裝細胞，轉染48h后，收集病毒上清，過濾，濃縮；

3)將目的細胞接種于12孔板，培養過夜；

4)棄去培養基并添加0.5mL polybrene培養基混合物，每孔加入對應病毒0.5mL，對照細胞孔用培養基替代病毒；繼續培養，慢病毒感染16h后，收集廢棄病毒液，更換1mL新鮮培養基繼續培養；

5)慢病毒感染48h后，通過熒光顯微鏡觀察GFP的表達效率，更換含puromycin的新鮮培養基，篩選穩轉細胞株，之后根據細胞狀態，每2-3天更換一次含有puromycin的新鮮培養基，直至沒有病毒感染的對照細胞被puromycin全部殺死，即得到穩轉細胞株；最后將細胞再進行一輪單克隆篩選，獲得目的細胞系CHO-APP/PS1。

5.根據權利要求4所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，其特征在于，步驟1)包括：根據人APP(WT)/PS1(WT)雙基因全長序列及慢病毒載體序列設計并合成引物，合成引物序列如下：

APP-F:CCTCCATAGAAGATTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCACT，

APP-R:GATCGCAGATCCTTCTCGAGCTAGTTCTGCATCTGCTCAA；

PS1-F:CCTCCATAGAAGATTCTAGAATGACAGAGTTACCTGCACC，

PS1-R:GATCGCAGATCCTTCTCGAGCTAGATATAAAATTGATGGA。

6.根據權利要求4所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，其特征在于，步驟2)中，轉染前一天，按照50％的細胞密度接種293T細胞。

7.根據權利要求4或6所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，其特征在于，步驟2)中，用0.22μm濾器過濾，采用millipore蛋白濃縮柱進行病毒濃縮。

8.根據權利要求4所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，其特征在于，步驟4)中，所述polybrene培養基混合物中polybrene的最適終濃度10μg/mL。

9.根據權利要求4或8所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型的構建方法，其特征在于，步驟5)中，含puromycin的新鮮培養基中puromycin的濃度為10μg/mL。

10.權利要求1-3任意一項所述的含人源APP和PSEN1基因的細胞模型在篩選能抑制Aβ1-42和Aβ1-40分泌的藥物中的應用。