[發明專利]一種同時檢測維生素K1、MK4和MK7的方法

有效

• 申請號: 202111093617.9
• 申請日: 2021-09-17
• 公開（公告）號: CN113933410B
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 趙蓓蓓;佘旭輝;林清娜;董衡;李卓陽
• 申請（專利權）人: 廣州金域醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 曾銀鳳;庹玖玲

本發明涉及一種同時檢測維生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步驟：取生物樣品，加入三種待測物的同位素內標混合溶液，再加入提取溶劑提取，離心，取上清液干燥后用復溶液溶解，得到待測樣品，采用液相色譜串聯質譜法檢測；所述液相色譜串聯質譜法所采用的色譜柱為C18色譜柱，所述C18色譜柱的粒徑為1.6～2.2μm，所述C18色譜柱的長度為40～60mm。本發明的檢測方法不僅能同時檢測維生素K1、MK4和MK7的方法，且特異性強，針對維生素K1、MK4和MK7都獲得良好的色譜分離度(保留時間相差大于0.5min)，基線低，基質干擾少，方法檢測限低，靈敏度高，且穩定性強。

技術領域

本發明涉及分析領域，特別是涉及一種同時檢測維生素K1、MK4和MK7的方法。

背景技術

維生素K是2-甲基-1,4-萘醌及其衍生物的總稱，目前已發現的天然脂溶性維生素K有兩種：一種是在苜蓿中提出的油狀物—維生素K1(VK1)，又稱葉綠醌；另一種是在腐敗魚肉中獲得結晶體維生素K2。維生素K2包括幾種不同的形式，人類飲食中最常見的維生素K2形式為甲萘醌-4(MK4)和甲萘醌-7(MK7)。MK4主要存在于動物產品中，如蛋黃、肉、肝和黃油。MK7則由細菌合成，主要存在于發酵食品中。

維生素K又稱凝血維生素，是合成各種凝血因子的必要輔助因子，在血液穩態中起不可或缺的作用。各種研究表明，缺乏維生素K會導致血液中活躍的凝血因子濃度降低，從而導致出血。此外維生素K營養狀況也與骨質疏松癥有關。人類流行病學和干預研究表明，維生素K可以減少骨質疏松癥患者的骨質流失，降低骨折風險。另有研究表明，維生素K2可抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖，并誘導肝細胞癌、卵巢癌等多種實體瘤和血液系統疾病的細胞凋亡，具有明顯的抗腫瘤作用，且與多種抗腫瘤藥物有協同作用。臨床給與維生素K2補充治療干預，可降低腫瘤發生風險。因此，體液中VK1、MK4和MK7的精準檢測是膳食攝入、營養狀況和疾病診斷治療監測的重要指標。準確靈敏地測定生物樣品中VK1、MK4和MK7的含量具有十分重要的意義。

但是，目前國內外關于維生素K的研究主要集中在VK1的檢測上。目前尚未有同時檢測多種樣品類型中VK1、MK4和MK7的報道。

發明內容

由于VK1、MK4和MK7具有相同的2-甲基-1,4-萘醌環，經過質譜三重四級桿篩選和碰撞后，三種化合物產生相同的定量離子(質荷比187)，因此三種化合物在質譜檢測上容易相互影響，導致檢測結果不準確。同時MK7在結構上由于含有相對較長的類異戊二烯鏈，理化性質上和VK1、MK4相差較大。已有的文章報道關于MK7的檢測，皆存在檢測時間過長，基線高，目標物響應極低的情況，同時由于基質干擾嚴重，MK7檢測穩定性差。VK1和MK4理化性質較為接近，在色譜行為上表現較為一致，一般檢測方法較難以將兩者在色譜上實現分離，導致檢測結果互相干擾。

基于此，本發明的目的是提供一種能同時檢測維生素K1、MK4和MK7的方法。本發明方法特異性強，針對維生素K1、MK4和MK7都獲得良好的色譜分離度(保留時間相差大于0.5min)，可避免由于相同的定量子離子產生的定量干擾；同時本方法在各種樣品類型檢測中，檢測結果基線低，基質干擾少，質譜通道無干擾。由于維生素K2在各種生物樣品類型中的含量較低，本方法檢測限低，靈敏度高，穩定性強，可同時提供VK1、MK4和MK7的精準檢測。

具體技術方案如下：

一種同時檢測維生素K1、MK4和MK7的方法，包括以下步驟：

取生物樣品，加入包含三種待測物的同位素內標混合溶液，再加入提取溶劑提取，離心，取上清液干燥后用復溶液溶解，得到待測樣品，采用液相色譜串聯質譜法檢測；

所述液相色譜串聯質譜法所采用的色譜柱為C18色譜柱，所述C18色譜柱的粒徑為1.6～2.2μm，所述C18色譜柱的長度為40～60mm。

在其中一些實施例中，所述色譜柱的粒徑為1.6～2.0μm，進一步為1.6～1.9μm，更進一步為1.6～1.8μm。