[發明專利]一種動物源性食品中恩諾沙星碳量子點熒光免疫快速檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202111086061.0
• 申請日: 2021-09-16
• 公開（公告）號: CN113721024A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 溫雷;李詩潔;張佳楠;李響
• 申請（專利權）人: 天津溫陽生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/533
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 張艷梅

1.一種動物源性食品中恩諾沙星碳量子點熒光免疫快速檢測試劑盒，包括盒體，盒體內有反應杯和試劑；其特征是，反應杯包被有抗原，所述試劑由辣根過氧化物酶標記抗體工作液；恩諾沙星系列標準溶液；20倍濃縮磷酸鹽洗滌液；10倍濃縮磷酸鹽復溶液；碳量子點熒光反應液A及碳量子點熒光反應液B組成。

2.根據權利要求1所述的一種動物源性食品中恩諾沙星碳量子點熒光免疫快速檢測試劑盒，其特征是，反應杯是由聚苯乙烯制備的單孔或8聯反應杯，容積為300μL或500μL或其他容積。

3.根據權利要求1所述的一種動物源性食品中恩諾沙星碳量子點熒光免疫快速檢測試劑盒，其特征是，碳量子點熒光反應液A包含過氧化氫和碳量子點，碳量子點熒光反應液B包含3,3',5,5'-四甲基聯苯胺和碳量子點。

4.根據權利要求1所述的一種動物源性食品中恩諾沙星碳量子點熒光免疫快速檢測試劑盒，其特征是，碳量子點的制備包括如下步驟：

(1)碳量子點的合成：將3g檸檬酸和5g尿素添加到10mL超純水中以形成透明溶液，然后將溶液在800W微波爐中加熱5分鐘，在此期間溶液從無色液體變為棕色，最后變為暗褐色的簇狀固體，冷卻至室溫后，加入20mL水以溶解產物；

(2)碳量子點的純化：將溶解后的產物于5000rpm離心10min后，裝入3500Da透析袋，常溫下用水透析過夜，得到棕色具有熒光的溶液，在365nm激發光激發下，在400nm-600nm處有熒光。

5.根據權利要求1所述的一種動物源性食品中恩諾沙星碳量子點熒光免疫快速檢測試劑盒，其特征是，所述反應杯包被抗原步驟包括：將恩諾沙星包被抗原用pH9.6碳酸鈉緩沖液稀釋至0.1μg/mL后向每個反應杯中加入100-300μL，置于4℃冰箱包被過夜，次日向包被抗原的反應杯中加入磷酸鹽洗滌液250μL，震蕩2min后，甩掉磷酸鹽洗滌液，如此重復3次，最后將反應杯在濾紙上拍干后，向每個反應杯中加入100-250μL酪蛋白封閉緩沖液，37℃封閉1-2h后棄去反應杯中酪蛋白封閉液，真空密封后在4℃保存。

6.使用權利要求1所述的試劑盒檢測恩諾沙星的方法，其特征是，向包被抗原后的反應杯中加入待測物標準溶液或處理好的待測樣品，并加入辣根過氧化物酶標記抗體工作液37℃溫育20min后向包被抗原的反應杯中加入磷酸鹽洗滌液200-500μL，震蕩2min后，甩掉磷酸鹽洗滌液，如此重復3次，最后將反應杯在濾紙上拍干后，加入熒光反應液A和熒光反應液B各50μL，37℃溫育10min后檢測熒光值，以加入不同濃度恩諾沙星標準品的熒光值求抑制率，以抑制率為縱坐標，恩諾沙星標準品濃度的對數為橫坐標作標準曲線，檢測限、靈敏度即抑制率為50％時所對應的恩諾沙星濃度IC50能從標準曲線上讀出。

7.根據權利要求6所述的檢測恩諾沙星的方法，其特征是，抑制率為：

抑制率(％)＝(F_x-F₀)/(F₀-F_b)×100％，其中F₀為檢測不含恩諾沙星的溶液時反應杯的檢測熒光值，F_x為檢測含有恩諾沙星的溶液時反應杯的檢測熒光值，F_b為未添加待測物標準溶液或待測樣品時反應杯的檢測熒光值，以恩諾沙星標準溶液抑制率為縱坐標，恩諾沙星標準品濃度的對數為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以通過樣品測定熒光值計算抑制率，并根據抑制率從標準曲線上讀出。

8.根據權利要求7所述的試劑盒檢測恩諾沙星的方法，其特征是，試劑盒對恩諾沙星的檢測限為0.3ng/mL，靈敏度為1.02ng/mL。

9.權利要求7所述的試劑盒檢測恩諾沙星的方法，其特征是，所述熒光值是在365nm激發波長下用熒光檢測儀測定各反應杯在560nm處的熒光值。