[發明專利]一種發酵罐生產兩性霉素B的分批補料發酵方法

在審

• 申請號: 202111085830.5
• 申請日: 2021-09-16
• 公開（公告）號: CN113832205A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 柳志強;張博;郭一平;楊曉章;黨萬利;吳哲明;黃良剛;周俊平;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;浙江天臺藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12Q3/00;C12N1/20;C12R1/465
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種發酵罐生產兩性霉素B的分批補料發酵方法。本發明分階段發酵調控策略能夠提供結節鏈霉菌一個最佳的菌體生長和產物合成的外部環境，有利于兩性霉素B的積累；采用本發明發酵方法，兩性霉素B在溫度在31℃，發酵溶氧維持在20％，發酵液殘糖控制在0.5～1％時，最終兩性霉素B在50噸發酵罐中產量為14g/l左右。

(一)技術領域

本發明涉及一種發酵罐生產兩性霉素B的分批補料發酵方法。

(二)背景技術

兩性霉素B(AmphotericinB，AmB)是重要的抗真菌類抗生素，自1966年上市以來，一直是深部真菌感染的首選藥物。AmB純品的顏色為黃色或橘黃色，由于其分子結構中親水基團與疏水基團的不對稱分布和帶有酸堿性的特點，使得AmB在水相及大部分有機相中的溶解度極低。AmB抗真菌譜廣、活性強，對念珠菌、隱球菌、毛霉菌、曲霉菌、組織胞漿菌、球孢子菌等大多數深部真菌都有很強的抗真菌作用，還能有效抑制假絲酵母菌和用于治療利什曼病等，因此兩性霉素B及其衍生物的應用仍然非常廣泛。

目前兩性霉素B的工業生產仍主要采用的是微生物發酵法，微生物發酵生產抗生素的水平高低除了與菌種遺傳特性有關，還與發酵培養基成分和發酵條件及發酵過程控制有關。對于前者目前有誘變育種和分子改造等手段，對于后者主要通過優化得到最適發酵培養基配方、發酵培養條件。目前，兩性霉素B仍存在產量較低，產業化生產發展緩慢的問題限制了兩性霉素B的發展，對其進行擴大培養的條件進行優化，尤其是大型發酵罐發酵工藝條件的優化對于工業生產具有非常重要的意義。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種提高大腸桿菌L-半胱氨酸合成量的發酵方法。

本發明采用的技術方法是：

一種發酵罐生產兩性霉素B的分批補料發酵方法，所述方法為：將結節鏈霉菌接種至種子培養基，獲得種子液；種子液接種至發酵培養基，進行發酵培養，發酵總時間120±36小時，發酵過程中參數控制如下：

(1)控制發酵體系pH維持在6.5～7.8，直至發酵結束；

(2)在發酵培養第0～36h，維持溫度在31±2℃，當發酵至36h時，將溫度降至26±2℃，維持該溫度直至發酵結束；

(3)發酵前期使菌體在自然DO條件下生長，當發酵體系DO值下降至20％～30％時，控制DO值維持在大于20％直至發酵結束；

控制發酵培養基中葡萄糖濃度，發酵過程中濃度下降到1％～2％時，進行恒速補料，控制葡萄糖含量為0.5％～1％至發酵結束。每隔12h對殘糖濃度進行實時檢測，根據殘糖濃度來補加液糖。

本發明通過對于兩性霉素B在發酵罐中的發酵工藝進行優化，可以了解兩性霉素B在擴大培養過程中可能中存在的問題，補料可以解除底物抑制、產物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；可以避免在分批發酵中因一次投料過多造成細胞大量生長所引起的影響，改善發酵流變學的性質；可用作控制細胞質量的手段，以提高發芽孢子的比例。葡萄糖的流加調節，避免了葡萄糖在整個發酵過程中濃度不均一，以及一次性補入大量葡萄糖，不利于菌體的生長代謝的問題。此外糖高會產生酸性物質，如乳酸等，造成菌體不長，pH下降；糖低營養不足，造成菌體不長。菌體不長或生長緩慢將會打破兩性霉素B生物合成過程中的正常代謝途徑，同時造成pH變化，最終形成更多復雜的副產物，不利于后期的分離純化。通過本發明的補料控制方法，可以保證發酵液中葡萄糖的相對穩定濃度，使得菌體生長的各個階段都可以保持最佳生產狀態，有效提高兩性霉素B的產率。

優選的，所述結節鏈霉菌為結節鏈霉菌CCTCC NO.M 2017426，已在CN110564718A中披露。

具體的，所述發酵罐容量為500L～10000L。