[發明專利]一種檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR方法

在審

• 申請號: 202111085250.6
• 申請日: 2021-09-16
• 公開（公告）號: CN113667776A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 徐雷鋒;明軍;楊盼盼;宋蒙
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/94
• 代理公司: 成都宏田知識產權代理事務所(普通合伙) 51337
• 代理人: 楊偉

本發明提供一種檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR方法。包括取待測百合植株的葉片，提取總RNA；以提取的百合葉片總RNA為模板，進行逆轉錄反應獲得cDNA；以獲得的cDNA為模板，利用特異性引物對CP?2F/R進行基于熒光染料SYBRGreenI的實時熒光定量PCR檢測；以不同濃度的含檢測基因片段的質粒PlAMV?CP2標準品為模板制作標準曲線；根據檢測結果Cq值判斷植株的帶病情況，根據標準曲線對帶病植株的病毒進行定量計算。本發明對侵染車前草花葉病毒的百合植株的鑒定具有快速簡便、靈敏度高及可重復性強的優點，其檢測靈敏度是常規RT?PCR的100倍，可用于進出境口岸和百合生產中車前草花葉病毒的快速診斷、定量檢測及監測防控。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，特別是涉及一種檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR方法。

背景技術

在生產中，百合采用無性繁殖方式進行繁殖，易感染多種病毒，導致其種球減產、花蕾畸形和凋落，嚴重影響了百合的產量和品質，我國種植的百合中檢測到PlAMV病毒逐漸成為一種危害百合生產的主要病害。百合感染PlAMV后，葉脈呈銹色，花蕾干枯死亡，發病后期壞死嚴重，導致大面積切花喪失商業價值。PlAMV屬甲型線狀病毒科(Alphaflexiviridae)，馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)成員)。PlAMV是單鏈正義RNA病毒，長約6100個核苷酸，全基因組包含5個開放閱讀框；ORF1編碼一個依賴RNA的RNA聚合酶，ORF2-4編碼三個重疊基因蛋白參與病毒的運動和ORF5編碼外殼蛋白。PlAMV具有廣泛的宿主范圍，該病毒除侵染車前草、百合外，還可侵染油菜、報春花、南天竹等植物，危害極為嚴重。

目前，病毒的檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗、直接組織印跡、逆轉錄環介導的等溫擴增、常規RT-PCR和實時熒光定量PCR(RT-qPCR)等，其中，RT-qPCR作為一種高效、便捷、穩定性好及可定量的檢測技術已廣泛應用于蔬菜、花卉、果樹等植物的病毒檢測中。

迄今為止，針對PlAMV的檢測開發了多種技術，用RT-LAMP方法對侵染本氏煙和百合的PlAMV進行檢測或者使用ELISA和RT-PCR方法檢測了入境哥斯達黎加百合的PlAMV，這些方法雖然可以檢測出PlAMV，但是在檢測靈敏度和定量等方面存在劣勢。因此，亟需建立適用于百合PlAMV快速靈敏的RT-qPCR檢測技術。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR方法，用于解決現有技術中對帶有PlAMV植株的鑒定操作繁瑣、靈敏度低和定量復雜等缺陷，本發明可為PlAMV的準確高效監測防控提供技術支持。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種快速鑒定百合中車前草花葉病毒侵染植株的方法，包括如下步驟：

(1)取待測百合植株的葉片，提取總RNA；

(2)以提取的百合葉片總RNA為模板，進行逆轉錄反應，獲得cDNA；

(3)以步驟(2)的cDNA為模板，利用特異性引物對CP-2F/R進行基于熒光染料SYBRGreenI的實時熒光定量PCR檢測；所述特異性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特異性引物的序列如下：

CP-2F：5’-TCTTCGATGGCCTCCTCAAC-3’，

CP-2R：5’-TAGGGATCGTGCCGTCTCAT-3’，

(4)以不同濃度的含有檢測基因片段的質粒PlAMV-CP2標準品為模板制作標準曲線；

(5)根據步驟(3)的檢測結果判斷植株的帶病情況，根據步驟(4)獲得的標準曲線對帶病植株的病毒進行定量計算。

本發明主要適用于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植株的鑒定。