[發明專利]一種檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR方法

在審

• 申請號: 202111085250.6
• 申請日: 2021-09-16
• 公開（公告）號: CN113667776A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 徐雷鋒;明軍;楊盼盼;宋蒙
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/94
• 代理公司: 成都宏田知識產權代理事務所(普通合伙) 51337
• 代理人: 楊偉

1.一種檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取待測百合植株的葉片，提取總RNA；

(2)以提取的百合葉片總RNA為模板，進行逆轉錄反應，獲得cDNA；

(3)以步驟(2)的cDNA為模板，利用特異性引物對CP-2F/R進行基于熒光染料SYBRGreen I的實時熒光定量PCR檢測，所述特異性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述特異性引物的序列如下：

CP-2F：5’-TCTTCGATGGCCTCCTCAAC-3’，

CP-2R：5’-TAGGGATCGTGCCGTCTCAT-3’，

(4)以不同濃度的含有檢測基因片段的質粒PlAMV-CP2標準品為模板制作標準曲線；

(5)根據步驟(3)的檢測結果判斷植株的帶病情況，根據步驟(4)獲得的標準曲線對帶病植株的病毒進行定量計算。

2.根據權利要求1所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于：所述總RNA提取的方法包括采用多糖多酚植物組織裂解法對百合葉片樣品進行提取。

3.根據權利要求1所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于：所述逆轉錄反應的反應體系及程序為：

7.0μL模板RNA

1.0μL Anchored Oligo(dT)₂₀Primer(0.5μg·μL^-1)

II RT/RI Enzyme Mix

1.0μL gDNA Remover

10.0μL 2×TS II Reaction Mix配置混合液。

所述混合液在50℃孵育15min，85℃加熱5s得到的cDNA用于實時熒光定量PCR。

4.根據權利要求1所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于：所述步驟(3)中，所述實時熒光定量PCR檢測的反應體系為：

cDNA 2.0μL，

CP-2F和CP-2R引物各0.5μL，

2×PerfectStart^TMGreen qPCR Super Mix 10.0μL，

RNase Free ddH₂O 7.0μL。

反應條件為：94℃預變性30s；94℃變性5s，退火15s，72℃延伸10s，39個循環，熔解曲線分析溫度范圍65～95℃。

5.根據權利要求4所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR檢測中熒光定量PCR擴增時，退火溫度為59.4℃。

6.根據權利要求1所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，所述步驟(3)中標準曲線的制作方法如下：

取百合中車前草花葉病毒外殼蛋白基因克隆質粒作為標準品，用RNase Free ddH₂O稀釋為1.3×10³～1.3×10⁹copies·μL^-1的10倍濃度梯度模板，然后進行實時熒光定量PCR擴增，擴增完成后，以Cq值為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，制作標準曲線。

7.根據權利要求6所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，所述標準曲線擴增效率(E)為98.7％，決定系數(R²)為0.990，標準曲線的方程為y＝-3.353Log₁₀^C+37.104，y為Cq值，C為濃度(單位為copies·μL^-1)。

8.根據權利要求1所述的檢測百合中車前草花葉病毒的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，在步驟(4)中待百合測植株帶病情況的判斷方法如下：當擴增曲線良好并且Cq35時，則為陽性，即判斷待測植株帶毒；反之，Cq≥35時，則為陰性，即判斷待測植株不帶毒，參考標準曲線，確定病毒濃度。