[發(fā)明專利]一種重組解脂耶氏酵母菌、其構(gòu)建方法以及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111083923.4
• 申請(qǐng)日: 2021-09-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113832044B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 施天穹;黃和;彭倩倩;沈琦;楊彩玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/60;C12N15/81;C12P7/02;C12R1/645
• 代理公司: 石家莊科誠(chéng)專利事務(wù)所(普通合伙) 13113
• 代理人: 張紅衛(wèi);蘇興娟

本發(fā)明公開(kāi)了一種重組解脂耶氏酵母菌及其構(gòu)建方法，該重組解脂耶氏酵母菌以解脂耶氏酵母菌為出發(fā)菌株，在解脂耶氏酵母的基因組中插入密碼子優(yōu)化的廣藿香醇合酶編碼基因PS，并將解脂耶氏酵母菌中內(nèi)源性角鯊烯合酶ERG9的啟動(dòng)子替換為銅離子抑制啟動(dòng)子pCTR1；本發(fā)明也公開(kāi)了上述重組解脂耶氏酵母菌的一種應(yīng)用，利用廉價(jià)銅離子作為誘導(dǎo)劑，在弱化廣藿香醇競(jìng)爭(zhēng)性途徑?角鯊烯生產(chǎn)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)廣藿香醇的高效生產(chǎn)。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化解脂耶氏酵母菌實(shí)現(xiàn)生物合成廣藿香醇的目的，適用于構(gòu)建產(chǎn)廣藿香醇的重組解脂耶氏酵母菌，構(gòu)建出的重組解脂耶氏酵母菌可用于廣藿香醇的生物合成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程的技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組酵母菌，具體地說(shuō)，是一種重組解脂耶氏酵母菌、其構(gòu)建方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)

合成生物學(xué)的目標(biāo)是通過(guò)包括模塊化設(shè)計(jì)在內(nèi)的工程學(xué)科，構(gòu)建新型基因裝置和系統(tǒng)，如具有獨(dú)特動(dòng)態(tài)行為的基因電路，以及生產(chǎn)生物燃料和天然生物制品的微生物細(xì)胞工廠。設(shè)計(jì)一個(gè)以復(fù)雜方式完成特定任務(wù)的生物系統(tǒng)，需要特征明確的生物組件，并了解它們的相互作用，以便提高設(shè)計(jì)和組裝的可預(yù)測(cè)性和效率，隨著合成生物學(xué)的協(xié)同和發(fā)展，代謝工程領(lǐng)域得到了極大的拓展。

作為一種公認(rèn)(GRAS)的安全生物體，解脂耶氏酵母正在成為代謝工程及合成生物學(xué)領(lǐng)域中一種至關(guān)重要的新型非模式微生物底盤(pán)細(xì)胞，與大腸桿菌相比，解脂耶氏酵母具有完整的內(nèi)膜系統(tǒng)和與植物相類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，更適合植物源蛋白質(zhì)的表達(dá)；除此之外，與大腸桿菌和釀酒酵母相比，解脂耶氏酵母屬于典型的產(chǎn)油酵母，細(xì)胞內(nèi)脂肪酸(Fattyacid)、脂酰輔酶A(Fattyacyl-CoA)以及乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)的積累量較高。因此，該酵母在生產(chǎn)植物萜類化合物(乙酰輔酶A衍生物，Acetyl-CoAderivedproducts)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，發(fā)展前景廣闊，并已通過(guò)基因工程用于生產(chǎn)一系列高價(jià)值萜類化合物，如β-胡蘿卜素，α-法尼烯、香葉醇。

在大多數(shù)研究中，外源基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá)都采用組成型強(qiáng)的啟動(dòng)子，如常用的pTEF啟動(dòng)子，pFBAin啟動(dòng)子，pTEFin啟動(dòng)子等。采用組成型啟動(dòng)子的缺點(diǎn)在于，其表達(dá)強(qiáng)度不可調(diào)控，過(guò)多的基因組成型強(qiáng)表達(dá)，或者過(guò)早表達(dá)，會(huì)造成宿主的代謝負(fù)擔(dān)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終影響目標(biāo)產(chǎn)物的總產(chǎn)量，而采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行外源基因的表達(dá)是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)能最大化常用的方式。目前，從解脂耶氏酵母中分離的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如plip1的強(qiáng)度極大地依賴于碳源并受到葡萄糖的抑制，限制了它們的應(yīng)用范圍。

最近，有研究人員從解脂耶氏酵母中分離出的銅離子激活、抑制型啟動(dòng)子而受到廣泛關(guān)注(可參考文獻(xiàn)Xiong X，Chen S.Expanding Toolbox for Genes Expression ofYarrowia lipolytica to Include Novel Inducible，Repressible，and HybridPromoters.ACS Synth Biol.2020Aug 21；9(8)：2208-2213.)。然而，將上述銅離子調(diào)控啟動(dòng)子用以誘導(dǎo)、抑制目的基因的表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道。

在合成生物學(xué)領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單、靈敏度高的增強(qiáng)外源基因表達(dá)、減弱主要競(jìng)爭(zhēng)途徑產(chǎn)物的構(gòu)建方法是該領(lǐng)域研究人員一直努力的方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，旨在提供一種重組解脂耶氏酵母菌，通過(guò)優(yōu)化酵母菌株實(shí)現(xiàn)生物合成廣藿香醇的目的；

本發(fā)明的另一個(gè)目的，旨在提供上述重組解脂耶氏酵母菌的一種構(gòu)建方法，以達(dá)到對(duì)該菌株簡(jiǎn)便、快速、有效、精準(zhǔn)構(gòu)建的目標(biāo)；

本發(fā)明還有一個(gè)目的，旨在提供上述重組解脂耶氏酵母菌的一種應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)提高廣藿香醇產(chǎn)量，同時(shí)降低副產(chǎn)物角鯊烯產(chǎn)量的目的。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案如下：