[發明專利]BmSPI38突變體及其應用

有效

• 申請號: 202111081313.0
• 申請日: 2021-09-15
• 公開（公告）號: CN113621056B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 李游山;張杰
• 申請（專利權）人: 陜西理工大學
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C12N15/15;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及BmSPI38突變體及其應用。BmSPI38是由SEQ ID NO.1中第23位至第80位組成，所述BmSPI38突變體是將BmSPI38氨基酸序列中，如SEQ ID NO.1所示第54位的甘氨酸突變為突變為精氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、組氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、色氨酸或谷氨酸獲得的。本發明的BmSPI38突變體均對枯草桿菌蛋白酶和彈性蛋白酶具有抑制活性，且當突變為精氨酸或賴氨酸后，還獲得了胰蛋白酶抑制活性，此類突變體可用于制備胰蛋白酶抑制劑，應用前景良好。

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及BmSPI38突變體及其應用。

背景技術

家蠶是一種具有巨大的經濟價值的絹絲昆蟲，有大量的基礎研究積累，已成為昆蟲生物化學、遺傳學和基因組學的最佳模型之一。我們前期的研究對免疫相關的家蠶蛋白酶抑制劑進行了系統鑒定，發現很多TIL(trypsin inhibitor-like cysteine-richdomain)類蛋白酶抑制劑在微生物添食感染后上調表達，暗示TIL類蛋白酶抑制劑可能參與家蠶的免疫過程。進一步研究表明，一個家蠶的TIL類蛋白酶抑制劑BmSPI38不僅能夠強烈抑制枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-1和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，而且能夠阻斷球孢白僵菌體壁降解蛋白酶CDEP-1誘導的家蠶的過度、有害黑化。

BmSPI38的活性和功能已較為清楚，但是其活性作用機制尚不完全清楚，針對可能影響TIL類蛋白酶抑制劑抑制特異性的潛在氨基酸位點的研究也比較有限，這直接影響了該抑制劑的遺傳改造和產業應用。

發明內容

本發明的目的之一是提供BmSPI38突變體，BmSPI38是由SEQ ID NO.1中第23位至第80位組成，所述BmSPI38突變體是將BmSPI38氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示第54位的甘氨酸突變為精氨酸(R)、賴氨酸(K)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、組氨酸(H)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、纈氨酸(V)、天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)、色氨酸(W)或谷氨酸(E)獲得的。

本發明的目的之二是提供所述BmSPI38突變體的構建方法，該方法是利用定點突變引物對如SEQ ID NO.2所示野生型BmSPI38的基因序列進行定點突變，得到所述BmSPI38突變體。

進一步的，所述BmSPI38突變體的構建方法，包括如下步驟：

S1、設計定點突變引物，使上下游引物都帶有突變位點；

S2、以BmSPI38-p28作為模板，使用DNA聚合酶，用特異性突變引物進行PCR反應擴增，反應產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；

S3、利用Dpn I進行酶切反應處理PCR產物；

S4、將酶切反應處理的PCR產物轉化入Trans1-T1感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序驗證，提取突變質粒；

S5、將突變質粒轉入宿主表達菌株中，誘導表達得到BmSPI38突變體。

本發明的目的之三是提供編碼所述BmSPI38突變體的基因。

本發明的目的之四是提供攜帶所述基因的質粒。

本發明的目的之五是提供攜帶所述質粒的宿主表達菌株。

本發明的目的之六是提供所述BmSPI38突變體作為枯草桿菌蛋白酶和彈性蛋白酶抑制劑的應用。