[發(fā)明專利]高效誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111079674.1
• 申請日: 2021-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN113789296B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 禹亞彬;祁付珍;王丹丹
• 申請（專利權(quán)）人: 淮安市第一人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/407;A61P1/16
• 代理公司: 淮安菁聯(lián)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32378
• 代理人: 張麗

本發(fā)明公開了一種高效誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的方法及應(yīng)用，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)長鏈非編碼RNA?LINC5657的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以及含有細(xì)胞因子HGF、bFGF、EG、OSM的培養(yǎng)基。本發(fā)明肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基每3天更換一次，僅需21天左右即可獲得具有肝細(xì)胞形態(tài)、功能的肝樣細(xì)胞（iHeps），且細(xì)胞功能較傳統(tǒng)方法更加成熟，可為臨床肝細(xì)胞移植提供可靠的細(xì)胞來源。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及過表達(dá)LINC5657的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞株在一種含有誘導(dǎo)劑HGF、EGF、bFGF和OSM的培養(yǎng)基中高效分化為肝細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

各種終末期肝病常常導(dǎo)致肝功能衰竭，給人類健康造成極大危害，是當(dāng)今世界范圍內(nèi)死亡的主要原因之一。目前肝細(xì)胞移植被認(rèn)為是治療急慢性肝衰的重要手段之一，但因缺乏足夠的供體限制了其在臨床上廣泛應(yīng)用。

近年來隨著干細(xì)胞技術(shù)的飛速發(fā)展，成人干細(xì)胞為體外研究提供了無限制的原代細(xì)胞來源。成人干細(xì)胞中以間充質(zhì)干細(xì)胞最具應(yīng)用前景，其具有來源充足、免疫原性低、可塑性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞體外向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，研究證實(shí)，在體外添加生長因子及細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，使其成為理想的替代肝細(xì)胞來源，充滿應(yīng)用前景。但是現(xiàn)階段上述方法誘導(dǎo)分化來的肝細(xì)胞功能不成熟、目標(biāo)細(xì)胞得率低下，而且臨床應(yīng)用移植細(xì)胞需要盡可能縮短誘導(dǎo)周期，上述誘導(dǎo)的方法往往至少需要1個(gè)月的時(shí)間，因此現(xiàn)有誘導(dǎo)方法難以滿足臨床需要，因此開發(fā)新的能夠在短時(shí)間內(nèi)將HuMSCs高效地誘導(dǎo)為成熟肝細(xì)胞的方法意義重大。

最近幾年，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（lncRNA）在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等過程中均扮演著重要角色，并通過干預(yù)lncRNA的表達(dá)達(dá)到了促進(jìn)細(xì)胞分化的目的。因此，我們希望可以將lncRNA用于誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的過程中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供一種高效誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的方法，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)長鏈非編碼RNA?LINC5657的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞株，并且使用一種含有誘導(dǎo)劑HGF、EGF、bFGF和OSM的培養(yǎng)基進(jìn)行干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。與目前普遍的誘導(dǎo)方法相比，極大提高了誘導(dǎo)效率。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

高效誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的方法，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達(dá)長鏈非編碼RNA?LINC5657基因的HuMSCs系，以及含有HGF，bFGF，EGF及OSM的IMDM培養(yǎng)基。

具體的包括以下步驟：

（1）人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取：新鮮臍帶獲取后置入無菌生理鹽水中，至超凈臺(tái)內(nèi)將臍帶華通膠分離置入培養(yǎng)瓶底部貼壁培養(yǎng)，加入含10%?胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO₂、37?℃培養(yǎng)箱中，4-5天后觀察組織塊周圍有梭形細(xì)胞生長移除組織塊繼續(xù)加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)70-80%匯合后進(jìn)行傳代；

（2）分化前準(zhǔn)備：第4代HuMSCs接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度為1×10⁸?/L，培養(yǎng)瓶內(nèi)是含10%?胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37?℃培養(yǎng)箱中；

（3）慢病毒轉(zhuǎn)染：待細(xì)胞達(dá)到50%-60%匯合時(shí)去除原培養(yǎng)基，加入不含胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基以及LINC5657慢病毒，挑選單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，最終得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株；

（4）HuMSC向肝細(xì)胞分化：去除原生長培養(yǎng)基，更換為含有HGF，bFGF，EGF及OSM的肝細(xì)胞誘導(dǎo)IMDM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37?℃培養(yǎng)箱中；

（5）肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基每3天更換一次，誘導(dǎo)分化21天后，收獲誘導(dǎo)后的細(xì)胞。