[發明專利]高效誘導人臍帶間充質干細胞分化為肝細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 202111079674.1
• 申請日: 2021-09-15
• 公開（公告）號: CN113789296B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 禹亞彬;祁付珍;王丹丹
• 申請（專利權）人: 淮安市第一人民醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/407;A61P1/16
• 代理公司: 淮安菁聯知識產權代理事務所(普通合伙) 32378
• 代理人: 張麗

1.高效誘導人臍帶間充質干細胞分化為肝細胞的方法，其特征在于：通過慢病毒轉染構建過表達長鏈非編碼RNA?LINC5657基因的HuMSCs系，以及含有HGF，bFGF，EGF及OSM的IMDM培養基，包括以下步驟：

（1）人臍帶間充質干細胞的獲取：新鮮臍帶獲取后置入無菌生理鹽水中，至超凈臺內將臍帶華通膠分離置入培養瓶底部貼壁培養，加入含10%?胎牛血清的L-DMEM培養基，置于5%CO₂、37?℃培養箱中，4-5天后觀察組織塊周圍有梭形細胞生長移除組織塊繼續加入培養基培養，待細胞達70-80%匯合后進行傳代；

（2）分化前準備：第4代HuMSCs接種于培養瓶中，細胞濃度為1×10⁸?/L，培養瓶內是含10%?胎牛血清的L-DMEM培養基，置于5%CO2、37?℃培養箱中；

（3）慢病毒轉染：待細胞達到50%-60%匯合時去除原培養基，加入不含胎牛血清的L-DMEM培養基以及LINC5657慢病毒，挑選單克隆細胞進行擴增，最終得到穩定轉染的細胞株；

（4）HuMSC向肝細胞分化：去除原生長培養基，更換為含有HGF，bFGF，EGF及OSM的肝細胞誘導IMDM培養基，置于5%CO2、37?℃培養箱中；

（5）肝細胞誘導分化培養基每3天更換一次，誘導分化21天后，收獲誘導后的細胞。

2.根據權利要求1所述的高效誘導人臍帶間充質干細胞分化為肝細胞的方法，其特征在于：所述人臍帶間充質干細胞為從成人臍帶中獲得的間充質干細胞。

3.根據權利要求1所述的高效誘導人臍帶間充質干細胞分化為肝細胞的方法，其特征在于：HGF濃度為20ng/ml，bFGF的濃度為10ng/ml，EGF濃度為20ng/ml，OSM的濃度為10ng/ml。

4.根據權利要求1所述的高效誘導人臍帶間充質干細胞分化為肝細胞的方法，其特征在于：IMDM培養基中不含有胎牛血清。

5.根據權利要求1所述的高效誘導人臍帶間充質干細胞分化為肝細胞的方法，其特征在于：所述人臍帶間充質干細胞的細胞表面標志分子通過流式細胞技術方法進行檢測，人臍帶間充質干細胞不表達或低表達CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而強表達間充質干細胞表面特異性抗原CD44、CD73、CD90、CD105。

6.權利要求要求1-5任一項所述制備方法制備得到的人臍帶間充質干細胞分化的肝細胞。