[發明專利]一種代謝工程改造大腸桿菌發酵制備β-丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 202111076165.3
• 申請日: 2021-09-14
• 公開（公告）號: CN113817659B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 周哲敏;徐建;周麗;崔文璟;劉中美;程中一;韓來闖;郭軍玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/64;C12N15/60;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/31;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種代謝工程改造大腸桿菌發酵制備β?丙氨酸的方法，屬于生物工程領域。本發明構建了一種工程菌株，通過游離型表達質粒分別過表達panD基因、aspA基因、大腸桿菌來源的ppc基因、gldA基因和dhaKLM基因，敲除了染色體上的lacI基因、乙醛羧酸循環抑制子iclR和富馬酸消耗途徑的fumA和fumC基因獲得高效生產β?丙氨酸的重組菌。該重組菌株能夠以廉價的甘油為底物，發酵生成附加值更高的β?丙氨酸，發酵50h，β?丙氨酸產量可達37.9g/L，為工業綠色、高效生產β?丙氨酸提供了技術支持。

技術領域

本發明涉及一種代謝工程改造大腸桿菌發酵制備β-丙氨酸的方法，屬于生物工程領域。

背景技術

β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一種β型氨基酸，已被廣泛應用于精細化工、醫藥、食品、飼料等多個領域，在人們的日常生活及生產過程中發揮著越來越重要的作用。目前工業合成β-丙氨酸的主要方法是化學合成法，該方法能耗較高，對設備要求嚴苛。微生物發酵法反應條件溫和，可以實現β-丙氨酸的綠色生產。但是發酵法高效生產β-丙氨酸的研究較少，尚未建立成熟的生產體系，限制了該方法在工業生產上的大范圍推廣。

Song等（Metabolic?engineering?of Escherichia?colifor?the?production?of3-aminopropionic?acid.Metabolic?Engineering.2015,30:121-129）以大腸桿菌為底盤菌株，構建微生物細胞工廠，以期通過好氧發酵過程高效生產β-丙氨酸。通過對底盤菌株的多輪改造，最終產量達到32.3?g·L^-1，為目前已知最高產量。但是，該研究尚未完全成熟，依舊限制了該方法在工業應用上的推廣。如該研究所構建工程菌株并未敲除有機酸等副產物的合成途徑，副產物的積累會影響菌體的生長，而且會降低底物轉化率，同時降低產物的化學純度。而且該研究構建工程菌株的過程并未全局性調控大腸桿菌胞內代謝途徑，導致代謝失衡，以至于β-丙氨酸的產量未隨著代謝途徑的疊加改造而逐步增加。

發明內容

針對現有的重組大腸桿菌生產β-丙氨酸產量較低的問題，本發明提供了一株產β-丙氨酸的重組大腸桿菌，通過在大腸桿菌中構建新的代謝途徑，使重組大腸桿菌能夠以甘油作為合成β-丙氨酸的原料，轉化低價值的原料為高附加值化學品。

本研究根據好氧發酵過程中大腸桿菌合成β-丙氨酸的代謝途徑（圖2），將β-丙氨酸的從頭合成途徑劃分為三大模塊，并分別命名為β-丙氨酸合成模塊（模塊一）、TCA模塊（模塊二）和底物酵解模塊（模塊三），并利用模塊化的調控策略對三大模塊內及模塊間的代謝流進行全局而系統的調控。

本發明的目的是提供一種高效合成β-丙氨酸的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌過表達了天冬氨酸-α-脫羧酶、天冬氨酸氨裂解酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油脫氫酶和/或二羥丙酮激酶，并敲除了乳糖操縱子阻遏蛋白、乙醛羧酸循環抑制子、延胡索酸酶。

在一種實施方式中，天冬氨酸-α-脫羧酶序列的GenBank:?QYO72381.1或NCBIReference?Sequence:?NP_001096055.1；天冬氨酸氨裂解酶序列的NCBI?ReferenceSequence:?NP_418562.4。

在一種實施方式中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶序列的NCBI?Reference?Sequence:NP_418391.1；甘油脫氫酶序列的NCBI?Reference?Sequence:?NP_418380.4；二羥丙酮激酶序列的NCBI?Reference?Sequence:?NP_415718.6、NP_415717.1、NP_415716.4。