[發明專利]一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111074920.4
• 申請日: 2021-09-14
• 公開（公告）號: CN113774049B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 張建琴;張瑞平;尹菲;孫菁華;張建珍;李大琪;秦雪梅
• 申請（專利權）人: 山西大學;山西醫科大學
• 主分類號: C12N11/02
• 分類號: C12N11/02;C12N9/10;A62D3/02;A62D101/04;A62D101/20
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，黑色素固定化酶復合載體的制備：

1.1將黑色素納米粒溶于水，超聲水浴震蕩使其完全溶解后得到黑色素水溶液，用0.1mol/LNaOH溶液調節其pH值為9-10；

1.2取與步驟1.1中黑色素水溶液等體積的聚乙二醇水溶液，用0.1mol/LNaOH溶液調節其pH值為9-10；

1.3將步驟1.1的黑色素水溶液逐滴加入步驟1.2的聚乙二醇水溶液中，攪拌12-20h后，離心，然后水洗至濾液澄清透明，將沉淀冷凍干燥得到羧基化黑色素納米材料，即黑色素固定化酶復合載體；

步驟2，谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4的獲得：將已接有谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4基因的菌液劃線于固體LB培養基中進行復蘇，復蘇后，挑取單菌落接種于1mL含50μg/mL卡那霉素的液體LB培養基中，37℃、振蕩培養14-16h，作為種子菌液；在16℃下，采用0.5mmol/LIPTG誘導谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4大量表達，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4成功表達后，使用HisTrapFF預裝柱，通過蛋白純化系統對其進行純化，用含有50-250mmol/L咪唑的緩沖液洗脫，對洗脫最終獲得的粗蛋白及不同洗脫組分進行電泳檢測，對含有較單一的谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4條帶的洗脫組分通過PBS緩沖液進行超濾，-20℃凍存備用；

步驟3，谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4的固定化：

3.1將黑色素固定化酶復合載體、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶于去離子水中，攪拌2-4h，獲得羧基活化的黑色素溶液；

3.2將步驟2獲得的谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4逐滴加入步驟3.1獲得的羧基活化的黑色素溶液中，控制反應體系的pH值在7-8進行?；磻罱K產物經30kDa分子量截留超濾管離心、水洗得到黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶；

所述谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4為飛蝗谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4。

2.根據權利要求1所述的一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的制備方法，其特征在于：所述步驟1.1中黑色素水溶液的濃度為1mg/mL。

3.根據權利要求1所述的一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的制備方法，其特征在于：所述步驟1.2中聚乙二醇為分子量2-10kDa的NH₂-PEG-COOH或SH-PEG-COOH；聚乙二醇水溶液的濃度為3-6mg/mL。

4.根據權利要求1所述的一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的制備方法，其特征在于：所述步驟1.3中離心用30kDa分子量截留超濾管，離心轉速為3500rpm，離心時間為10min。

5.根據權利要求1所述的一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的制備方法，其特征在于：所述步驟3.1中黑色素固定化酶復合載體、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的質量比為1：1：1；羧基活化的黑色素溶液的濃度為1mg/mL。

6.根據權利要求1所述的一種黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的制備方法，其特征在于：所述步驟3.2中谷胱甘肽轉移酶LmGSTE4和羧基活化的黑色素溶液的質量比為1～3：1～2，?；磻臅r間為12-20h，離心轉速為3500rpm，離心時間為10min。

7.一種基于權利要求1-6任一項所述方法制備得到的黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶。

8.一種權利要求7所述的黑色素固定化谷胱甘肽轉移酶的應用，其特征在于：用于有機磷農藥的催化降解。