[發(fā)明專利]一種黑色素固定化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111074920.4
• 申請日: 2021-09-14
• 公開（公告）號: CN113774049B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建琴;張瑞平;尹菲;孫菁華;張建珍;李大琪;秦雪梅
• 申請（專利權(quán)）人: 山西大學(xué);山西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N11/02
• 分類號: C12N11/02;C12N9/10;A62D3/02;A62D101/04;A62D101/20
• 代理公司: 太原申立德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，針對游離谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在降解農(nóng)殘過程中存在穩(wěn)定性差、不能反復(fù)利用等問題，本發(fā)明將昆蟲解毒酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶固定化于黑色素納米粒表面，制備得到黑色素固定化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，并將其用于降解有機(jī)磷農(nóng)殘。黑色素納米粒作為固定化載體的引入，提高了固定化酶的穩(wěn)定性和應(yīng)用的安全性。昆蟲解毒酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶固定化后應(yīng)用于農(nóng)殘?zhí)幚恚瑢︸R拉硫磷降解效果與游離酶相當(dāng)，同時，穩(wěn)定性能更優(yōu)于游離酶。另外，利用黑色素強(qiáng)金屬離子絡(luò)合能力，可清除殘留的重金屬離子，對殘留有毒物質(zhì)起到進(jìn)一步清除效果。本發(fā)明可以應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥脫除領(lǐng)域，環(huán)保無污染，后處理簡單，酶的穩(wěn)定性高，脫除農(nóng)殘的效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黑色素固定化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

酶介導(dǎo)的生物修復(fù)是將農(nóng)藥生物降解和生物轉(zhuǎn)化為無害化學(xué)物質(zhì)的一種策略。然而，由于天然酶的高成本和不穩(wěn)定性，在工業(yè)生產(chǎn)過程中，通常難以有效地去除有毒化合物，因此可以通過將酶固定在某些合適的載體材料上來解決。酶固定化是20世紀(jì)50年代興起的技術(shù)，其可以增加酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，增強(qiáng)酶的活性。使得以上問題得到很好的解決。

當(dāng)今農(nóng)藥殘留仍然是一個未能解決的熱點(diǎn)話題。農(nóng)藥殘留對水環(huán)境的生態(tài)平衡、食品和中藥材安全以及人類健康都造成嚴(yán)重的危害。其中有機(jī)磷農(nóng)藥的長期低劑量的暴露可引起人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂，且對人體產(chǎn)生致癌和生殖毒性等危害。酶催化作為一種技術(shù)，通過酶促反應(yīng)將農(nóng)藥降解為無毒的小分子化合物或其他化合物的同時，還能夠起到不破壞食品、藥品或環(huán)境中的有效成分，不造成二次污染的功效。

基于以上背景，本發(fā)明設(shè)計了黑色素納米粒固定化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，用于對有機(jī)磷農(nóng)藥的脫除。

發(fā)明內(nèi)容

針對游離谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在降解農(nóng)殘過程中存在穩(wěn)定性差等問題，本發(fā)明提供了一種黑色素固定化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種黑色素固定化谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，黑色素固定化酶復(fù)合載體的制備：

1.1將黑色素納米粒溶于水，超聲水浴震蕩使其完全溶解后得到黑色素水溶液，用0.1mol/L?NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為9-10；

1.2取與步驟1.1中黑色素水溶液等體積的聚乙二醇水溶液，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值為9-10；

1.3將步驟1.1的黑色素水溶液逐滴加入步驟1.2的聚乙二醇水溶液中，攪拌12-20h后，離心，然后水洗至濾液澄清透明，將沉淀冷凍干燥得到羧基化黑色素納米材料，即黑色素固定化酶復(fù)合載體；

步驟2，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的獲得：將已接有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因的菌液劃線于固體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后，挑取單菌落接種于1mL含50μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、振蕩培養(yǎng)14-16h，作為種子菌液；在16℃下，采用0.5mmol/L?IPTG誘導(dǎo)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶大量表達(dá)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶成功表達(dá)后，使用HisTrapFF預(yù)裝柱，通過pure蛋白純化系統(tǒng)對其進(jìn)行純化，用含有50-250mmol/L咪唑的緩沖液洗脫，對洗脫最終獲得的粗蛋白及不同洗脫組分進(jìn)行電泳檢測，對含有較單一的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶條帶的洗脫組分通過PBS緩沖液進(jìn)行超濾，-20℃凍存?zhèn)溆茫?/p>

步驟3，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的固定化：

3.1將黑色素固定化酶復(fù)合載體、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶于去離子水中，攪拌2-4h，獲得羧基活化的黑色素溶液；