[發(fā)明專利]一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測(cè)序文庫(kù)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111060927.0
• 申請(qǐng)日: 2021-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN113604540B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 谷紅倉(cāng);王云飛;車仙榮;陶宛琪;錢飛箭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州圣庭醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6886;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 杭州華鼎知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

本發(fā)明公開了一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測(cè)序文庫(kù)的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，構(gòu)建方法包括：步驟一，以血液樣本獲得ctDNA；用末端修飾酶對(duì)ctDNA的末端進(jìn)行加ddATP修復(fù)；步驟二，采用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA的CpG島；步驟三，用末端修飾酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行末端修復(fù)并在3’端加A?Tailing；步驟四，用DNA連接酶對(duì)DNA進(jìn)行甲基化接頭連接；步驟五，采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化非甲基化胞嘧啶；步驟六，甲基化文庫(kù)PCR富集；步驟七，切膠回收；本方法解決了現(xiàn)有技術(shù)利用血液進(jìn)行RRBS構(gòu)建ctDNA文庫(kù)失敗率高的問題，提高接頭和酶切位點(diǎn)結(jié)合的效率，推進(jìn)了液體活檢技術(shù)的發(fā)展。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測(cè)序文庫(kù)的方法。

背景技術(shù)

DNA甲基化是在真核生物中一種DNA化學(xué)修飾，可以在不改變DNA序列的情況下改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化通常出現(xiàn)在CpG二核苷酸，通過甲基轉(zhuǎn)移酶的作用增加在胞嘧啶的5’碳位增加一個(gè)甲基基團(tuán)。甲基化可以通過親代細(xì)胞遺傳給子代細(xì)胞，也可以在細(xì)胞中從頭合成。甲基化程度作為一種可逆的DNA修飾方式，參與基因表達(dá)的調(diào)控，異常的高甲基化或低甲基化會(huì)與許多疾病包括癌癥有密切關(guān)系。

通過結(jié)合基因組DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)基因組的甲基化進(jìn)行測(cè)序。簡(jiǎn)化DNA甲基化測(cè)序通過使用對(duì)甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶富集CpG含量高的區(qū)域，再通過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增和Illumina測(cè)序，可以實(shí)現(xiàn)單堿基檢測(cè)的分辨率和測(cè)序數(shù)據(jù)的高利用率。基于甲基化信號(hào)的高靈敏、位點(diǎn)多、有組織特異性等特點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中可以廣泛應(yīng)用于癌癥早篩、療效監(jiān)控、癌癥溯源等領(lǐng)域。

液體活檢作為一種非侵襲性的檢測(cè)方法，在臨床上可以更快速、簡(jiǎn)單地獲得樣本，也可以最大程度減輕對(duì)病人身體的傷害，更容易被接受，并可以通過多次采集樣本進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。壞死或凋亡的細(xì)胞釋放到血液中的 DNA，被稱為循環(huán)游離 DNA （cfDNA）；而在腫瘤患者的血液中，一部分 cfDNA 來自死亡的腫瘤細(xì)胞，這部分 DNA 被定義為循環(huán)腫瘤 DNA（ctDNA）。 ctDNA和cfDNA大小非常接近，目前無法通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段分開。即使在腫瘤患者中，ctDNA僅占從血液中分離到的小片段的DNA的極少一部分，因此，自然斷裂的cfDNA連接接頭、進(jìn)入文庫(kù)，造成了大量的數(shù)據(jù)浪費(fèi)，稀釋了酶切對(duì)于CpG島的富集作用。所以，利用傳統(tǒng)RRBS構(gòu)建ctDNA文庫(kù)失敗率較高，給液體活檢技術(shù)的發(fā)展和推廣帶來了阻礙。市場(chǎng)需要一種能夠阻礙ctDNA與甲基化接頭的連接，使酶切富集CpG島區(qū)域的效果得到放大。同時(shí)，通過使用相同的緩沖液，使操作流程簡(jiǎn)單，減少試劑和人員成本，減少反復(fù)純化造成的DNA損失，并且容易轉(zhuǎn)化成自動(dòng)化建庫(kù)流程的RRBS測(cè)序文庫(kù)的方法，本發(fā)明解決這樣的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測(cè)序文庫(kù)的方法，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)利用血液進(jìn)行RRBS構(gòu)建ctDNA文庫(kù)失敗率高的問題，推進(jìn)了液體活檢技術(shù)的發(fā)展。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測(cè)序文庫(kù)的方法，包括如下步驟：

步驟一，以新鮮采集、未經(jīng)過凍融的血液樣本為材料，獲得ctDNA；用末端修飾酶對(duì)ctDNA的末端進(jìn)行加ddATP修復(fù)；

步驟二，采用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA；

步驟三，用末端修飾酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行末端修復(fù)并在3’端加A-Tailing，將dATP摻入平末端DNA片段的3’端；

步驟四，用DNA連接酶對(duì)DNA進(jìn)行甲基化接頭連接，再將各個(gè)標(biāo)簽序列標(biāo)記的樣本混合；

步驟五，采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化非甲基化胞嘧啶，轉(zhuǎn)化后的DNA立即進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增或保存于-80℃下；