[發(fā)明專利]一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測序文庫的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111060927.0
• 申請日: 2021-09-10
• 公開（公告）號: CN113604540B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 谷紅倉;王云飛;車仙榮;陶宛琪;錢飛箭
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州圣庭醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6886;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 杭州華鼎知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

1.一種利用血液循環(huán)腫瘤DNA快速構(gòu)建RRBS測序文庫的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，以新鮮采集、未經(jīng)過凍融的血液樣本為材料，獲得ctDNA；用末端修飾酶對ctDNA的末端進行加ddATP修復：

其具體步驟為，以新鮮采集的肺癌的外周血樣品為檢測對象，將病人外周血經(jīng)過二次離心分離出血漿，再從血漿中分離ctDNA；

1）樣品取15ng ctDNA，然后用水補齊到17μl，加到96孔板中，按照如下反應(yīng)體系進行DNA末端修飾反應(yīng)：DNA 17μl，KlenowExo- 0.5μl，1mM ddATP 0.5μl，10×CutSmartbuffer2μl；

2）在每個樣本孔中加入1μl的末端修飾反應(yīng)混合物；

3）通過輕輕震蕩來混合反應(yīng)體系，并短暫離心；

4）將樣本放入熱循環(huán)儀中，熱蓋溫度設(shè)為85℃，按照如下程序進行孵育反應(yīng)：程序1 30℃10分鐘；程序2 37℃10分鐘；程序3 70℃5分鐘；程序4 4℃hold；

5）孵育結(jié)束后，離心30秒；

步驟二，采用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA：

1）樣品按照如下反應(yīng)體系進行限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)：上步產(chǎn)物20μl，MspI 0.5μl，10×CutSmart 0.1μl，水0.4μl；

2）在樣品和8孔中分別加入1μl和3μl消化混合物；

3）通過輕輕震蕩來混合反應(yīng)體系，并短暫離心；

4）將樣本放入熱循環(huán)儀中，熱蓋溫度設(shè)為85℃，按照如下程序進行孵育反應(yīng)：程序1 37℃30分鐘；程序2 75℃10分鐘；程序3 4℃hold；

5）孵育結(jié)束后，離心30秒；

步驟三，用末端修飾酶對基因組DNA進行末端修復并在3’端加A-Tailing，將dATP摻入平末端DNA片段的3’端：

1）按照如下反應(yīng)體系進行末端修復反應(yīng)：上步產(chǎn)物21μl，KlenowExo- 0.5μl，dNTP 0.4μl，10×CutSmart 0.2μl，水0.9μl，其中dNTP由10mMdATP,1mMdCTP,1mMdGTP 組成；

2）在每個樣本孔中加入2μl末端修復混合物；

3）通過輕輕震蕩來混合反應(yīng)體系，并短暫離心；

4）將樣本放入熱循環(huán)儀中，熱蓋溫度設(shè)為85℃，按照以下程序進行孵育反應(yīng)：程序1 30℃10分鐘；程序2 37℃10分鐘；程序3 70℃5分鐘；程序4 4℃hold；

5）孵育結(jié)束后，離心30秒；

步驟四，用DNA連接酶對DNA進行甲基化接頭連接，再將各個標簽序列標記的樣本混合：

1）按照如下反應(yīng)體系進行接頭連接反應(yīng)：上步產(chǎn)物23μl，100mM ATP0.1μl，T4連接酶0.2μl，10×CutSmart0.3μl，0.15μM甲基化接頭2.4μl；甲基化接頭購買合成后，使用lowTE溶解至100μM作為母液儲存，再取部分母液稀釋至0.15μM的工作液；

2）在每個樣本中加入0.5μl接頭連接混合物和2.5μl接頭；

3）通過輕輕震蕩來混合反應(yīng)體系，并短暫離心；

4）將樣本放入熱循環(huán)儀中，熱蓋溫度設(shè)為25℃，按照以下程序進行孵育反應(yīng)：程序1 16℃1-3小時；程序2 70℃10分鐘；程序3 4℃Hold；

5）孵育結(jié)束后，離心30秒；

6）將24個不同標簽序列標記的樣本全部轉(zhuǎn)移到一個1.5ml離心管中混合，然后用30μllowTE緩沖液洗滌每個樣本孔，并最終與樣本混合；

7）在每個混合的樣本文庫中加入1.8倍的VAHTS DNA Clean Beads磁珠，在室溫下旋轉(zhuǎn)試管30分鐘，以促進磁珠和文庫DNA的結(jié)合；

8）短暫離心樣本管，將樣本管置于DynaMagTM-2磁力架上分離磁珠，室溫分離10分鐘，小心取出上清溶液；

9）用1毫升80％新鮮配制的乙醇清洗磁珠兩次；

10）待乙醇完全揮發(fā)后，用40μl lowTE緩沖液洗脫文庫DNA；

步驟五，采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化非甲基化胞嘧啶，轉(zhuǎn)化后的DNA立即進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增或保存于-80℃下：

1）根據(jù)QIAGENEpiTect快速亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換試劑盒的產(chǎn)品說明書進行甲基化處理，并亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方案按照如下程序進行操作：程序1 98℃5分鐘；程序2 60℃20分鐘；程序398℃5分鐘；程序4 60℃20分鐘；程序5 20℃hold；當熱循環(huán)儀溫度降至20℃后，應(yīng)盡快進入試劑盒的純化步驟以減少DNA損失；

2）用30μl的TE緩沖液洗脫轉(zhuǎn)化完成的DNA；亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA應(yīng)立即進行聚合酶鏈式反應(yīng)擴增或保存于-80℃下；

步驟六，甲基化文庫PCR富集：在對文庫富集前，取部分亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的文庫進行PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化，這樣能確保足夠的文庫DNA生成，同時避免過度擴增引入較高的duplication；將得到的PCR反應(yīng)混合物分別分配到各個PCR孔中，離心 PCR板孔，進行后續(xù)PCR擴增，從10個PCR循環(huán)數(shù)開始，依次遞增2個循環(huán)至確立可以獲得可靠文庫的最適循環(huán)數(shù)；再將剩余的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的文庫根據(jù)最適循環(huán)數(shù)進行擴增，純化，洗脫文庫DNA；

步驟七，通過凝膠電泳對DNA文庫中條帶在170-400bp的DNA片段進行切膠回收，經(jīng)過純化、洗脫，對切膠回收的文庫進行質(zhì)控和混合，最后進行Illumina平臺測序，測序上樣量按照常規(guī)Illumina文庫的60％密度進行簇生成，混合的測序文庫摻入30％-50％的phiX平衡文庫；其中具體的操作步驟為：將DNA文庫在4％agarose TAE-gel瓊脂糖凝膠上電泳2小時，在1：10000稀釋的SYBR Green I中染色1小時；根據(jù)DNA ladder切膠回收170-400bp的DNA片段；用QIAGEN MinElute凝膠純化試劑盒純化170-400bp的DNA片段，去除非目標序列包含PCR引物二聚體；

所述步驟四中的甲基化接頭包括：RRBS-1，RRBS-2，RRBS-3，RRBS-4，RRBS-5，RRBS-6，RRBS-7，RRBS-8，RRBS-9，RRBS-10，RRBS-11，RRBS-12；RRBS-1的上游序列如SEQ01，下游序列如SEQ13；RRBS-2的上游序列如SEQ02，下游序列如SEQ14；RRBS-3的上游序列如SEQ03，下游序列如SEQ15；RRBS-4的上游序列如SEQ04，下游序列如SEQ16；RRBS-5的上游序列如SEQ05，下游序列如SEQ17；RRBS-6的上游序列如SEQ06，下游序列如SEQ18；RRBS-7的上游序列如SEQ07，下游序列如SEQ19；RRBS-8的上游序列如SEQ08，下游序列如SEQ20；RRBS-9的上游序列如SEQ09，下游序列如SEQ21；RRBS-10的上游序列如SEQ10，下游序列如SEQ22；RRBS-11的上游序列如SEQ11，下游序列如SEQ23，RRBS-12的上游序列如SEQ12，下游序列如SEQ24；

所述步驟六中的甲基化文庫PCR富集的擴增引物包括：UniversalPrimer SEQ25，RRBS-R701 SEQ26，RRBS-R702 SEQ27，RRBS-R703 SEQ28，RRBS-R704 SEQ29，RRBS-R705 SEQ30和RRBS-R706 SEQ31。