[發明專利]一種基因工程高產豐加霉素的淀粉酶產色鏈霉菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202111055438.6
• 申請日: 2021-09-09
• 公開（公告）號: CN113801834B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 宋陽;申屠旭萍;俞曉平;張祥麗;張子軒
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;C12N15/66;C12P19/40;C12R1/525
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發明提供了一種基因工程高產豐加霉素的淀粉酶產色鏈霉菌及其構建方法和應用。本發明通過基因工程方法構建重組質粒pIB139?RelA，并轉入淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes?1628)中構建得到，所述豐加霉素高產粉酶產色鏈霉菌過量表達天藍色鏈霉菌ppGpp合成酶RelA基因，RelA基因過量表達產物可以正向調控豐加霉素生物合成，用于豐加霉素生產。本發明所獲得的菌株發酵生產豐加霉素產量至少提高到1568mg/L，是原始菌株產量的10倍，為工業生產提高豐加霉素產量提供新的技術支持。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及基因工程菌株及其構建方法，尤其涉及基因工程高產豐加霉素的淀粉酶產色鏈霉菌及其構建方法和應用。

背景技術

豐加霉素是一種核苷類抗生素，分子式為C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C1連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環，核心結構為吡咯嘧啶核苷類似物。其作用機理主要是通過抑制微生物的轉運而影響菌體的生長，可以廣泛用于醫療、制藥、農業等領域。近年來發現，豐加霉素可以用作農用抗生素，抑制多種植物病原真菌的生長，如黃瓜枯萎病菌、水稻紋枯病菌等。此外，豐加霉素由于是鏈霉菌的天然代謝產物，對環境污染小，對植物生長也有一定的調節作用，是一種理想的生物農藥。相對于化學合成，生物法合成效率更高，反應條件溫和，對環境污染小，生產成本低，是目前合成豐加霉素的主要技術手段。

豐加霉素是鏈霉菌的次級代謝產物，合成途徑復雜，受到微生物內多種調控因子的調控，單一途徑基因的調節無法大幅度提高產物的產量。目前豐加霉素的產量較低，還無法進行工業化生產。采用紫外誘變等方式可以提高次級代謝產物的產量，但是由于次級代謝產物篩選困難，需要大規模的篩選才能獲得高產菌株。CN201310170658.2、CN201310170665.2、CN201310168066.7、CN201310170674.1、CN201310168980.1、CN201410783862.6、CN201510966008.8等報道了通過加強淀粉酶產色鏈霉菌部分基因的表達來提高豐加霉素產量以及通過抗藥性突變株篩選提高豐加霉素產量的研究，但豐加霉素產量提高有限。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高豐加霉素發酵產量的方法，通過過表達鏈霉菌內關鍵代謝調控因子ppGpp，對胞內的核苷代謝進行調控。同時ppGpp也是鏈霉菌內代謝的調控因子，可以激活次級代謝途徑，激活途徑特異性轉錄調控因子的轉錄，所以設計通過過量表達天藍色鏈霉菌RelA基因，提高淀粉酶產色鏈霉菌胞內ppGpp合成，從而提高淀粉酶產色鏈霉菌的豐加霉素產量。

本發明的技術方案如下：

本發明首先提供了一種基因工程高產豐加霉素的淀粉酶產色鏈霉菌，其為通過基因工程方法由質粒pIB139和RelA基因構建重組質粒pIB139-RelA，并轉入淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes?1628)中構建得到，所述豐加霉素高產粉酶產色鏈霉菌過量表達ppGpp合成酶RelA基因，所述RelA基因序列如SEQ?ID?No.1所示。

所述淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces?diastatochromogenes?1628)在CN201410128610.X、CN201410128645.3中已經公開，其已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC?No.2060.本發明還提供了一種基因工程高產豐加霉素的淀粉酶產色鏈霉菌的構建方法，其包括如下步驟：

1)以天藍色鏈霉菌基因組為模板，以引物RelA-F和RelA-D為引物，PCR擴增獲得含有NdeI和XbaI兩個酶切位點的RelA基因；

RELA-F的序列為：ggaattccatatgccagacgaggcccagccactgaccg；