[發明專利]一種表達豬流行性腹瀉病毒S蛋白的口服重組釀酒酵母的制備與應用

在審

• 申請號: 202111042639.2
• 申請日: 2021-09-07
• 公開（公告）號: CN113736676A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 黃金海;孫瑞騏;郭艷余
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/50;C12N15/81;C07K14/165;A61K39/215;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 琪琛

本發明公開了一種表達豬流行性腹瀉病毒S蛋白的口服重組釀酒酵母的制備與應用，其包含S蛋白第234位至633位的S1結構域和第640位至736位部分S2結構域。將體外構建的S蛋白截短體完整轉錄單位GPD?PEDV?S?TU，通過同源重組整合于酵母基因組中，利用Aga1?Aga2表面展示系統將S蛋白截短體展示于酵母細胞表面，獲得S蛋白表面展示型的重組酵母菌株ST1814G?PEDV?S，并利用所得菌株制備口服重組酵母。本發明的口服重組酵母成本低廉、生產使用安全、操作簡便、安全有效，具有免疫保護作用，為豬流行性腹瀉的防控提供選擇。

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及一種制備豬流行性腹瀉病毒S蛋白的口服重組釀酒酵母的制備方法與應用。

背景技術

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性和高度傳染性腸道疾病，其特點是各年齡階段的豬腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬高死亡率^[1]。自1971年在英國和比利時首次報道后，隨后傳播到中國、加拿大、日本、韓國等多個國家，PED的流行與暴發給世界養豬業造成了巨大的經濟損失^[2,3]。

PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約28kb，帶有一個5'帽和一個3'多聚腺苷酸化的尾，中間至少7個開放閱讀框(ORF1a、ORF1b、ORF2～6)，從其5'→3'方向依次編碼復制酶多聚蛋白1ab(pp1ab)、纖突蛋糖白(S)、ORF3蛋白、囊膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)^[4,5]。S蛋白是PEDV重要的結構蛋白和免疫原性抗原攜帶主要的B淋巴細胞抗原表位，B細胞表位是由抗原表面的親水性氨基酸組成，易于接近B細胞受體和抗體分子并被識別，能誘導機體產生與PEDV特異性結合的中和抗體，PEDV S1區域包含受體結合域和主要中和位點，決定病毒毒力，因此，S1蛋白常被作為開發PEDV基因工程疫苗的一個重要的靶蛋白^[6,7]。

目前，接種疫苗仍然是預防豬流行性腹瀉大流行的的最主要手段^[8]。然而，疫苗的開發由于病毒頻繁的進化和新生仔豬最易感這一事實而變得復雜^[9]。另外，PEDV只在小腸絨毛腸細胞中感染和復制^[10]，因此疫苗需要在腸道誘發良好而持久的黏膜免疫。目前市場上商品化疫苗主要是PEDV減毒和滅活疫苗。滅活病毒是安全的，但在誘導局部免疫反應方面通常不夠有效且免疫持續時間短。基于經典毒株CV777的傳統疫苗與變異毒株交叉保護較低，不能針對當前流行的毒株提供完全的保護，而且減毒活疫苗又存在毒力增強的可能^[11,12]。無論使用哪種疫苗，都不能在接種疫苗的動物中預防病毒血癥和PEDV的傳播。因此，需要一種能夠快速生產PEDV疫苗的新策略作為防范大流行的優先事項。

口服免疫被認為是誘導腸黏膜免疫的有效途徑^[13]。我們假設一個新的基于酵母表面展示技術的PEDV疫苗生產平臺可以提供潛在的保護性免疫。釀酒酵母(S.cerevisiae)，一種非致病性酵母，是表達病毒或腫瘤抗原的理想生物，可以快速設計以表達新的抗原靶點，是細胞表面展示最常見的宿主^[14-17]。與細胞內表達的病毒蛋白相比，病毒抗原在細胞表面或壁面上的顯示可以促進宿主免疫系統的識別，從而增強它們在接種疫苗的宿主中獲得保護性免疫的能力。酵母還被證明具有天然佐劑活性^[18]，使表達的蛋白在與酵母細胞壁成分一起給藥時更具免疫原性^[19]。最重要的是，有研究表明重組釀酒酵母顯示出對非自身抗原誘導強烈的宿主免疫反應的能力^[20]。此外，釀酒酵母由于其可食性，使其成為口服疫苗遞送的潛在工具。總之，基于釀酒酵母表面展示技術平臺可以快速工程化表達新抗原并以低成本發酵，有效調控菌群結構，激活黏膜免疫，快速生產匹配流行PEDV毒株等優勢，成為安全、方便使用疫苗研發的新寵，為PEDV的防控提供了新思路。

發明內容