[發(fā)明專利]一種表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S蛋白的口服重組釀酒酵母的制備與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111042639.2
• 申請(qǐng)日: 2021-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN113736676A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃金海;孫瑞騏;郭艷余
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/50;C12N15/81;C07K14/165;A61K39/215;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 琪琛

1.一種表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S蛋白截短體的重組釀酒酵母，ST1814G-PEDV-S，其包含S蛋白的234位至736位氨基酸。

2.一種豬流行性腹瀉病毒S蛋白的截短體，優(yōu)選為第234至736位氨基酸，序列特征為SEQ ID No.1，為包含第234位至633位的S1結(jié)構(gòu)域和第640位至736位部分S2結(jié)構(gòu)域。

3.表達(dá)權(quán)利要求2所述蛋白的基因，包含S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域，即從第700位至1899位堿基和部分S2結(jié)構(gòu)域，從第1918位至2208位堿基，其核苷酸序列為SEQ ID No.2。

4.構(gòu)建權(quán)利要求1所述所述重組酵母的質(zhì)粒GPD-PEDV-S-TU，序列特征為SEQ ID No.3，由權(quán)利要求3所述基因片段和POT-GPD-TU載體組成。

5.制備豬流行性腹瀉病毒S蛋白截短體重組釀酒酵母的方法，將體外構(gòu)建的S蛋白截短體完整轉(zhuǎn)錄單位GPD-PEDV-S-TU，通過同源重組整合于釀酒酵母基因組，利用Aga1-Aga2表面展示系統(tǒng)將S蛋白截短體展示于酵母細(xì)胞表面，獲得S蛋白截短體表面展示型的重組釀酒酵母菌株ST1814G-PEDV-S，并利用所得菌株制備口服重組釀酒酵母。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備豬流行性腹瀉病毒S蛋白截短體重組釀酒酵母的方法，具體包括以下步驟：

(1)編碼PEDV-S基因的PCR擴(kuò)增：參考實(shí)驗(yàn)室留存的含有PEDV S基因的質(zhì)粒pMD18-T-S的基因序列，序列特征SEQ ID No.4；以pMD18-T-S質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增優(yōu)選的S蛋白截短體編碼基因，用于酵母載體連接；

(2)編碼PEDV-S序列與Aga2基因串聯(lián)：通過BamHI單酶切線性化POT-GPD-TU載體，利用無縫克隆連接S基因片段至表面展示表達(dá)載體POT-GPD-TU上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，用S基因檢測(cè)引物進(jìn)行PCR及測(cè)序驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒GPD-PEDV-S-TU，其序列特征為SEQ ID No.3；

(3)S蛋白截短體釀酒酵母重組菌株的構(gòu)建：將重組質(zhì)粒GPD-PEDV-S-TU與同源臂SURs、篩選標(biāo)簽Trp編碼序列進(jìn)行酶切拼接，以獲得含有豬流行性腹瀉病毒S基因序列的重組基因，并整合到釀酒酵母基因組中，經(jīng)營養(yǎng)缺陷型平板篩選后獲得重組菌株；

(4)利用所得菌株制備口服重組釀酒酵母。

7.權(quán)利要求1所述豬流行性腹瀉病毒S蛋白截短體的重組釀酒酵母在制備豬流行性腹瀉病毒口服疫苗中的應(yīng)用。