[發(fā)明專利]KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的構建及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111042614.2
• 申請日: 2021-09-07
• 公開（公告）號: CN113897369A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發(fā)明（設計）人: 陳曉東;陳瑜;王旭升;何佳;王婧薷;楊榮華
• 申請（專利權）人: 佛山市第一人民醫(yī)院（中山大學附屬佛山醫(yī)院）;中山大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

本發(fā)明公開了KRT10定點基因敲入P2A?CrePR1?T2A?tdTomato小鼠模型的構建及應用。所述構建方法包括制備sgRNA，構建Cas9/sgRNA質粒；構建KRT10定點基因敲入P2A?CrePR1?T2A?tdTomato的重組打靶載體；將所述Cas9/sgRNA質粒和所述重組打靶載體注射到供體小鼠的受精卵中，得到轉染受精卵；將所述轉染受精卵移植到假孕母鼠的子宮中，誕下F0代小鼠，對所述F0代小鼠進行基因型鑒定，同源重組呈現(xiàn)陽性的小鼠即為嵌合體小鼠；將所述嵌合體小鼠與野生型的小鼠雜交，后代經(jīng)基因型鑒定，同源重組呈現(xiàn)陽性的小鼠即為F1代小鼠；將所述F1代小鼠進行雜交，鑒定正確重組且沒有隨機插入的后代小鼠即為小鼠模型。

技術領域

本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種KRT10定點基因敲入 P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的構建及應用。

背景技術

表達KRT10(角蛋白10)的Krt10⁺細胞位于皮膚的棘層，由基底層分化而來，屬于分化的角質細胞。Krt10⁺細胞在維持細胞分化、保持皮膚屏障等功能方面發(fā)揮了重要作用。目前，尚未有研究報道關于Krt10⁺細胞的其他作用。并且，對于Krt10⁺細胞在其損傷修復、逆分化過程中發(fā)揮的作用知之甚少。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的在于提供KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的構建及應用，以解決現(xiàn)有技術中所存在的一個或多個技術問題，提供至少一種有益的選擇或創(chuàng)造條件。

本發(fā)明一方面提供了KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的構建方法，包括如下步驟：

通過合成或是合成后體外轉錄的方式獲得sgRNA，構建Cas9/sgRNA質粒，所述sgRNA的核苷酸序列為：5’-AGTCTCTTCATACGGGCCACTGG-3’(SEQ ID NO.1)；

構建KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的重組打靶載體；

將所述Cas9/sgRNA質粒和所述重組打靶載體通過顯微注射的方式注射到供體小鼠的受精卵中，得到轉染受精卵；

將所述轉染受精卵移植到假孕母鼠的子宮中，誕下F0代小鼠，對所述F0 代小鼠進行基因型鑒定，同源重組呈現(xiàn)陽性的小鼠即為嵌合體小鼠；

將所述嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交，后代經(jīng)基因型鑒定，同源重組呈現(xiàn)陽性的小鼠即為F1代小鼠；

鑒定所述F1代小鼠，正確重組且沒有隨機插入的即為在KRT10基因啟動子后面定點敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的小鼠，得到所述小鼠模型。

進一步，所述P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進一步，所述重組打靶載體是通過同源重組的方式在KRT10基因終止密碼子位點定點敲入所述P2A-CrePR1-T2A-tdTomato得到 Krt10-P2A-CrePR1-T2A-tdTomato表達框。

進一步，所述重組打靶載體包含長度約為2kb的5’同源臂、 P2A-CrePR1-T2A-tdTomato和長度約為2kb的3’同源臂。

進一步，所述供體小鼠為C57BL/6J小鼠。

進一步，所述假孕母鼠為C57BL/6J小鼠。

進一步，采用PCR鑒定方法對所述F0代小鼠進行基因型鑒定；F0代小鼠鑒定方法包括以下引物：

EGE-STY-061-L-GT-F：5’-GCAGAAAAGAATCGCAAGGATGCTG-3’(SEQ ID NO.3)；