[發明專利]KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的構建及應用

在審

• 申請號: 202111042614.2
• 申請日: 2021-09-07
• 公開（公告）號: CN113897369A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 陳曉東;陳瑜;王旭升;何佳;王婧薷;楊榮華
• 申請（專利權）人: 佛山市第一人民醫院（中山大學附屬佛山醫院）;中山大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 朱繼超

1.KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

獲取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的sgRNA，構建Cas9/sgRNA質粒；

構建KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的重組打靶載體；

將所述Cas9/sgRNA質粒和所述重組打靶載體注射到供體小鼠的受精卵中，得到轉染受精卵；

將所述轉染受精卵移植到假孕母鼠的子宮中，誕下F0代小鼠，對所述F0代小鼠進行基因型鑒定，同源重組呈現陽性的小鼠即為嵌合體小鼠；

將所述嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交，后代經基因型鑒定，同源重組呈現陽性的小鼠即為F1代小鼠；

鑒定所述F1代小鼠，正確重組且沒有隨機插入即為在KRT10基因啟動子后面定點敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的小鼠，得到所述小鼠模型。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述重組打靶載體是通過同源重組的方式在KRT10基因終止密碼子位點定點敲入所述P2A-CrePR1-T2A-tdTomato得到Krt10-P2A-CrePR1-T2A-tdTomato表達框。

4.根據權利要求1至3任一項所述的構建方法，其特征在于，所述重組打靶載體包含長度約為2kb的5’同源臂、P2A-CrePR1-T2A-tdTomato和長度約為2kb的3’同源臂。

5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述供體小鼠為C57BL/6J小鼠；優選地，所述假孕母鼠為C57BL/6J小鼠。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，采用PCR鑒定方法對所述F0代小鼠進行基因型鑒定；F0代小鼠鑒定方法包括以下引物：

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的EGE-STY-061-L-GT-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的EGE-STY-061-L-GT-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的EGE-STY-061-R-GT-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的EGE-STY-061-R-GT-R。

7.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，采用PCR鑒定方法對所述F1代小鼠進行基因型鑒定；F1代小鼠鑒定方法包括以下引物：

核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的EGE-STY-061-WT-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的EGE-STY-061-WT-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的EGE-STY-061-Mut-F，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的EGE-STY-061-Mut-R。

8.根據權利要求6或7所述的構建方法，其特征在于，所述鑒定方法的反應條件為：94℃持續2min；98℃持續10s，67℃持續30s，68℃持續5min，15個循環；98℃持續10s，56℃持續30s，68℃持續5min，25個循環；68℃維持10min。

9.一種KRT10定點基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato的小鼠模型，其特征在于，由權利要求1至8任一項所述構建方法獲得。

10.權利要求9所述小鼠模型在KRT10基因對Krt10⁺細胞發育和分化相關研究中的應用。