[發明專利]一種用于檢測FLT3基因突變的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 202111041056.8
• 申請日: 2021-09-07
• 公開（公告）號: CN113502332B
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 羅景燕;李靜芳;許少飛;賴炳權
• 申請（專利權）人: 廣東永諾醫療科技有限公司;廣州永諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;郝傳鑫

本發明公開了一種用于檢測FLT3基因突變的引物、探針及試劑盒，屬于基因檢測領域。本發明用于檢測FLT3基因突變的引物、探針包括針對性檢測FLT3基因D835位點突變和FLT3基因I836位點突變的引物、探針。本發明的引物及試劑盒依托于數字PCR檢測技術，與目前其他檢測FLT3突變的技術相比，簡化了檢測的步驟，具有檢測過程簡單高效、絕對定量、靈敏度高等優點。本發明為攜帶FLT3基因D835或I836del突變的AML患者進行輔助診斷和臨床治療效果監測提供有力的技術支持，有著廣闊的應用前景和產業化前景。

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種用于檢測FLT3基因突變的引物、探針及試劑盒。

背景技術

FLT3基因位于染色體13q12.2，有24個外顯子，編碼的蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員之一,全稱是FMS樣酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3），在造血細胞存活、增殖和分化中起重要作用。FLT3蛋白由位于細胞外區域的免疫球蛋白樣細胞外結構域、跨膜結構域、近膜結構域（JMD）、酪氨酸激酶結構域中斷（TKD）和小的C末端域等5個結構域組成。據2015年中國腫瘤統計報告，中國白血病發病人數為75300/年，死亡人數為53400/年，其中成人急性髓系白血病(AML)約占成人白血病的65%，兒童AML約占兒童白血病的25%。在臨床上，FLT3基因的激活突變是急性髓細胞性白血病（AML）患者中是最常見的基因改變和預后不良因素。在約三分之一的AML患者中存在FLT3基因的突變，其中最常見突變的兩種形式是內部串聯重復(ITD)以及酪氨酸激酶結構域(TKD)中的點突變，而后者最主要的突變位點是D835和I836。

近年來，AML的治療效果隨化療方案的不斷改進和分子靶向藥物的開發而取得很大進展，在國內靶向治療藥物gilteritinib（吉瑞替尼）通過中國國家藥品監督管理局（NMPA）審批，用于治療FLT3突變陽性的復發或難治性急性髓系白血病。但是微小殘留病變（minimal residual disease,MRD）仍然是影響AML預后的一大難題。微小殘留病變是指白血病誘導化療完全緩解后，在體內殘留少量白血病細胞的狀態。MRD作為評價預后的敏感指標，在患者經過治療得到完全緩解后，怎樣準確檢出混雜在正常造血細胞中的量的白血病細胞是問題的關鍵。而白血病細胞的殘留量，取決于檢測方法的靈敏性。FLT3 D835和I836突變在AML患者中，其突變率可以成為MRD的重要指標之一。所以，在FLT3靶向的治療過程中，FLT3 D835和I836突變的持續跟蹤檢測對AML病人預測疾病的進展、指導的藥物治療選擇和預后有著重要的意義。

目前針對FLT3-TKD突變常用的檢測技術主要有限制性內切酶+PCR電泳法、傳統的Sanger測序和二代測序法。但這些檢測方法均存在一些缺點。比如限制性內切酶法是無法做到100％有效的識別野生型DNA進行切割，容易造成檢測假陽性結果，降低試劑盒使用的準確性，特別是樣品中的突變率較低時，使用限制性內切酶切割來判斷樣品中是否存在突變的準確率和靈敏度都很低；傳統的Sanger測序檢測通量低，而且檢測的靈敏度也不高：1％~10％。而NGS的檢測雖然通量大，檢測靈敏度相對毛細管電泳法有很大提升，但NGS方法成本昂貴，數據分析復雜耗時長，靈敏度只有1%左右。檢測結果的準確性直接影響臨床疾病的診斷和治療效果的判斷，因此本領域需要一種能夠更加靈敏、簡便、準確地檢測FLT3D835和I836突變的方法。數字PCR (digital PCR)是近年來新出現的技術，它的原理是將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現“單分子模板PCR擴增”，PCR擴增后，經生物芯片分析儀進行熒光強度檢測。與陰性微滴相比，包含核酸分子的陽性微滴的熒光信號強度增加，根據泊松分布的原理，通過陽性微滴比例計算目標核酸分子的絕對拷貝數。整個過程不依賴于標準曲線和參照樣本，直接檢測樣本獲得目標序列的拷貝數。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種用于檢測FLT3基因突變的引物、探針及試劑盒，該檢測試劑盒簡單高效、絕對定量、靈敏度高。