[發明專利]提高胰高血糖素樣肽六連體在畢赤酵母中表達水平的方法

有效

• 申請號: 202111035939.8
• 申請日: 2021-09-06
• 公開（公告）號: CN113462713B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 楊彩峰;王楠;彭華康;郭文芳;王夢琪;李剛強;劉德虎
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/16;C12N15/55;C12N15/31;C12N15/67;C12R1/84
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍

本發明公開了提高胰高血糖素樣肽六連體在畢赤酵母中表達水平的方法。本發明基于轉錄組測序分析畢赤酵母低水平表達菌株和高水平表達菌株的差異基因，篩選出一個轉錄水平差異顯著的新基因GESE。本發明利用畢赤酵母CRISPR/Cas9基因敲除技術敲除畢赤酵母宿主中GESE基因后發現6×mGLP?1在畢赤酵母菌株中的表達水平得到顯著提高。由此，本發明提供了一種提高胰高血糖素樣肽六連體在畢赤酵母中表達水平的方法，包括將宿主畢赤酵母菌株中的GESE基因敲除或進行突變。本發明還進一步提供了胰高血糖素樣肽六連體酵母表達載體以及GESE基因編輯載體。本發明為提高外源蛋白基因在畢赤酵母中的表達水平提供基礎研究和新途徑。

技術領域

本發明涉及胰高血糖素樣肽六連體的重組表達方法，尤其涉及提高胰高血糖素樣肽六連體在畢赤酵母中表達水平或表達量的方法，屬于胰高血糖素樣肽六連體的重組表達領域。

背景技術

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，由胰島素相對缺乏導致糖類代謝功能紊亂引起，腸源性激素胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)因其依賴葡萄糖濃度促進胰島β細胞分泌胰島素來降低血糖水平，不會造成嚴重低血糖而引起廣泛關注，但由于其在血液中的半衰期只有幾分鐘，限制了GLP-1在醫療上的應用。胰高血糖素樣肽六連體（6×mGLP-1）是在已有的研究基礎上，分別對天然GLP-1分子內DPP-IV與Trypsin敏感位點的氨基酸殘基進行替換(His⁷-Ala⁸突變為His⁷-Ser⁸/Gly⁸,Lys^26,34突變為Gln²⁶，Asn³⁴/Asp³⁴)、C末端添加Cys、首尾相連形成6個串聯重復、C末端添加His-tag、密碼子優化，并轉化到畢赤酵母中，使其在畢赤酵母中分泌表達，但是其在畢赤酵母中表達水平低，使其生產和純化的成本過高，不能滿足工業生產的需求。

畢赤酵母是目前在工業生產重組蛋白中應用最為廣泛一種酵母菌種，相對于其他表達系統，畢赤酵母表達系統具有可高密度發酵，操作簡便快捷，同時作為真核生物又具備了原核生物所沒有的特性，如蛋白的翻譯后加工和修飾，包括二硫鍵形成、糖基化和脂酰化等。對于一些有細胞毒性的外源重組蛋白，可以將蛋白定位于畢赤酵母的過氧化物酶體中，既可以保證畢赤酵母不被毒性傷害，又可以防止蛋白酶對外源蛋白的降解，對于分泌到胞外的重組蛋白來說，由于畢赤酵母本身的分泌蛋白較少，在后期外源蛋白的分離和純化可簡化操作。極適合工業大規模發酵生產。但隨著畢赤酵母表達系統的廣泛應用發現，并不是所有外源蛋白基因均能在畢赤酵母中高效表達，傳統方法如使用強啟動子、密碼子優化、增加拷貝數、基因的融合表達、優化發酵條件等對提高大多外源蛋白在畢赤酵母中的表達水平十分有限，甚至起不到作用。

由于6×mGLP-1在畢赤酵母中表達水平低，使其生產和純化的成本過高，該缺陷嚴重限制了6×mGLP-1在醫藥上的廣泛應用，亟待改進。

發明內容

本發明的目的之一是提供提高胰高血糖素樣肽六連體（6×mGLP-1）在畢赤酵母中表達水平的方法；

本發明的目的之二是提供一種胰高血糖素樣肽六連體基因酵母表達載體；

本發明的目的之三是提供一種GESE基因編輯載體。

本發明的目的之四是將胰高血糖素樣肽六連體基因酵母表達載體以及GESE基因編輯載體應用于提高胰高血糖素樣肽六連體（6×mGLP-1）在畢赤酵母中表達水平。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：