[發明專利]極速RNA建庫方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202111033722.3
• 申請日: 2021-09-03
• 公開（公告）號: CN113718343A
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 劉娜;江翱;羅元廷;曹振;宋東亮
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發明提供一種極速RNA建庫方法，其步驟包括：在total RNA加入逆轉錄阻礙探針5.8S/18S/28S rRNA probe mix以及隨機引物與total RNA混合后退火；加入逆轉錄酶，進行1st cDNA的合成；使用聚合酶合成2nd cDNA，磁珠回收2nd cDNA，得到ds?cDNA；ds?cDNA進行片段化、末端修復及接頭連接；文庫擴增及回收。并公開了對應的極速RNA建庫試劑盒。可以在3h內完成RNA的極速建庫，可以在病原診斷領域有廣泛的應用。

技術領域

本發明專利涉及一種極速RNA建庫方法及試劑盒，屬于生物技術領域。

背景技術

RNA-seq是一種通過檢測基因表達水平來分析基因組的技術。轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能和基因結構，揭示生物發育及疾病發生過程，已經被廣泛的利用于基礎研究、臨床診斷和藥物研究等領域。RNA-seq技術能夠更為快速、準確的提供更多的生物體轉錄信息，在生物醫學領域被廣泛的應用。在臨床診斷方向，通過RNA-seq技術，可以一次性完成細菌、真菌、RNA病毒和寄生蟲等多種病原的檢出，檢出率高、靈敏度高。尤其是2019年末至今的新冠病毒的疫情時代，RNA-seq技術可以在第一時間獲取未知病毒的基因組信息，通過構建進化樹揭示病原相關性、分析新冠病毒的進化來源、研究新冠病毒的致病病理機制等。

常規RNA-seq的建庫策略是，通過Oliog dT磁珠進行mRNA捕獲或者rRNA的去除；然后高溫進行Mg2+的片段化；再通過1^st cDNA的合成，2^nd cDNA的合成及末端修復；再通過接頭連接及去接頭的磁珠純化；最后進行文庫的擴增及純化。建庫時長6~8h。但是，對于臨床診斷行業，病原樣本RNA提取的濃度較低，一般5~10ng/μL左右，再進行宿主rRNA的去除，建庫成功率偏低。因此，病原檢出一般采用不去除宿主rRNA的方式進行RNA建庫，但是提取的總RNA中，由于宿主rRNA的占比在90%，會造成低拷貝的病原檢出率下降甚至會出現漏檢的概率。而且，對于病原樣本的檢出能做到一天內提取建庫加上機出報告，是最理想的策略。因此，亟需一種可以去宿主rRNA的快速建庫方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種RNA快速建庫方法，具有耗時短、操作簡單和損失小的優點。

本發明采取的技術方案為：一種極速RNA建庫方法，其特征在于其步驟包括：

（1）提取樣本中的total RNA，加入逆轉錄阻礙探針5.8S/18S/28S rRNA probemix（探針的序列參考CN202110257924 .X）以及隨機引物與total RNA混合后退火，以去除total RNA中的rRNA；

（2）加入逆轉錄酶，以步驟（1）的產物為模板，進行1st cDNA的合成；

（3）使用聚合酶，以步驟（2）合成的1st cDNA為模板合成2nd cDNA，磁珠回收DNA，得到ds-cDNA；

（4）采用轉座酶Tn5對ds-cDNA進行片段化；

（5）文庫擴增及回收。

優選的，步驟（1）中的反應體系為total RNA、逆轉錄阻礙探針、隨機引物和DEPC水。

優選的，步驟（1）中的退火程序為85℃ 5 min，72℃ 2 min，60℃ 10 min，保存于4℃。

優選的，步驟（2）中逆轉錄酶為SuperScript? III 逆轉錄酶、SuperScript? II逆轉錄酶、Hifair? Ⅱ Reverse Transcriptase 、Hifair? IV Reverse Transcriptase的一種或多種。

優選的，步驟（2）中逆轉錄程序為25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。