[發明專利]篩選轉基因植物的組合物和方法

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• 申請號: 202111029399.2
• 申請日: 2021-09-02
• 公開（公告）號: CN113621644A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 王益行;呂曉榮;宋淼泉;凌建群
• 申請（專利權）人: 杭州先端生物科技有限公司;江蘇吉銳生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/53;C12N15/54;C12N5/10;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/02
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本發明公開了篩選轉基因植物的組合物和方法。本發明利用植物花青素生物合成途徑中的酶類基因DFR、LDOX、UFGT構建了篩選植物轉基因的載體以及含有該載體的宿主細胞，并將所述載體及宿主細胞用于篩選轉基因植物，巧妙地利用花青素的顯色，在愈傷組織階段即可篩選出植物轉基因的陽性細胞，有效地減輕轉化后篩選的工作量。本方法能夠在懸浮培養的愈傷組織中進行無細胞損傷的篩選，篩選過程無需進行組織化學檢測或利用特殊的儀器設備，肉眼觀測即可。利用本方法可獲得高陽性率的轉基因愈傷組織，極大縮短了篩選培養的時間。

技術領域

本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及一種植物轉基因陽性細胞的篩選方法。

背景技術

現行的植物基因工程一般通過農桿菌介導侵染宿主植物的愈傷組織，通過農桿菌的T-DNA介導將外源基因序列轉化、并隨機插入到植物細胞中基因組中。因常規轉基因方法構建的轉基因細胞效率較低，需要通過一定的篩選方法對陽性細胞進行篩選，目前常用篩選方法為抗生素篩選和除草劑篩選。但受限于植物細胞和轉染方法的特殊性，該篩選方式將獲得大量假陽性細胞，繼而形成嵌合體細胞團。此外，潮霉素或除草劑對液體環境培養的植物愈傷組織篩選能力遠低于固體培養的植物愈傷細胞，實踐操作中難以進行。因此，迫切需要尋找一種能夠在植物轉基因系統中，使用便捷、可靠性更高、且同時適用于固體和液體培養的新篩選方法。

我們在初始研究中，目標是建立一種可視化、不損傷細胞即可進行持續檢測鑒定的植物轉基因篩選方法。最為直接的是以GFP、RFP等熒光蛋白和目的蛋白進行共表達，在相應激發光源下持續進行篩選，直至獲得完全熒光的愈傷組織。但由于植物的細胞壁和胞外結構對常規熒光檢測有強烈干擾，GFP等熒光蛋白的篩選不得不借助高精度儀器，操作要求較高，難以實現大量、簡便的篩選。

花青素是一類在植物中廣泛存在的次級代謝產物，屬于黃酮類物質?；ㄇ嗨刭x予植物繽紛的色彩，在植物發育過程中，具有使植物免受紫外輻射、抗病原菌侵染等重要生理作用。同時，花青素在治療心臟病和癌癥，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要療效。因此，可以利用花青素的這些特點，將花青素合成途徑的結構基因及其調控因子基因作為一類可視化、安全和有效的標記基因來轉化植物。不僅可以有效地減輕轉化后篩選的復雜工作，目的性強，也大為提高實驗結果的準確度和可信度，為開展轉化后的分析工作奠定了很好的基礎。

現有技術中，已有利用花青素顯色來篩選轉基因植物的方法。中國專利CN102352375B將花青素合成途徑中的兩個基因轉錄因子bi和cl基因運用到植物轉基因中，根據基因在植株上的顏色表現，有選擇的保留有價值的轉化材料。中國專利CN102719450B將花青素調節基因Rosea 1和Delila整合進菊花基因組，轉基因植物莖部在自然條件下出現明顯紫紅色，與對照有明顯差異，從而區別轉基因與非轉基因植株。然而，現有技術中的篩選方法大多需要經過植物組織培養過程，即被轉化的植物細胞要通過組織培養的方法進行植株再生，經過多代篩選，才能得到轉基因陽性的植株，而植物組織培養過程存在繁瑣冗長，耗時長，假陽性多等問題。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明提供了能夠篩選轉基因植物的組合物和方法。

本發明利用植物花青素生物合成途徑中的部分酶來構建高效的表達載體，將花青素合成所需的酶基因及外源基因轉入水稻愈傷組織中，通過花青素在愈傷組織的表達來快速、高效地篩選轉基因植物陽性細胞。

圖1是植物中常見花色素苷生物合成途徑(劉娟,馮群芳,張杰.二氫黃酮醇4-還原酶基因(DFR)與花色的修飾[J].植物生理學報,2005,41(006):715-719.)，該途徑內的不同酶類具有一定的時空表達特異性。經過多次試驗證明，向植物中轉入合成途徑中的酶類DFR、ANS、3GT可能是本發明中較好的植物轉基因篩選的路線選擇。其中虛線方框內的路徑為葡萄中花青素的合成路徑，葡萄中與上述酶類對應的基因為：DFR、LODX、UFGT。