[發明專利]一種TIM-3/CD28融合蛋白及所述融合蛋白修飾的CAR-T細胞

有效

• 申請號: 202111027147.6
• 申請日: 2021-09-02
• 公開（公告）號: CN113621077B
• 公開（公告）日: 2023-01-31
• 發明（設計）人: 馬春紅;高立芬;趙松柏;梁曉紅;婁雅琳;劉慧敏;王婷
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N5/10;C12N15/867;A61K39/00;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李箏

1.一種CAR-T細胞，其特征在于，所述T細胞表面修飾的嵌合抗原受體中，包括一種TIM-3/CD28融合蛋白，包括TIM-3分子的胞外區及CD28分子的跨膜區和胞內區，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述T細胞表面修飾的嵌合抗原受體中包括共刺激分子4-1BB；還包括抗原識別蛋白及跨膜結構域；所述抗原識別蛋白為CD8 SP-FMC63-Fc；所述跨膜結構域采用CD8分子跨膜區；

所述T細胞表面修飾的嵌合抗原受體為CD8 SP-FMC63-Fc-CD8 TM-41BB-CD3ζ-T2A-TIM3 ECD-CD28 TM-CD28 ICD。

2.如權利要求1所述CAR-T細胞，其特征在于，所述CAR-T細胞的構建方法，所述構建方法為：首先進行慢病毒包裝，待病毒包裝成功后再感染T細胞構建CAR-T；

具體步驟為：

（1）取6×10⁶個HEK293T細胞接種于10 cm²細胞培養皿中，過夜，待細胞密度達到80%時，更換6 mL新鮮DMEM培養基；

（2）2h后進行包裝病毒，向EP管中混入下述質粒，混勻；加入450 μl無菌水，

；

（3）逐滴加入50 μLCaCl₂，混勻，形成混合液1；

（4）另準備新的1.5 mL EP管，加500 μL2×HBS；

（5）將混合液1加入到步驟（4）中的2×HBS中，混勻，形成混合液2，室溫靜置15 min，可見渾濁；

（6）將混合液2緩慢加入HEK293T細胞中，十字法混勻，培養箱培養24 h；

（7）24 h后更換6 mL新鮮DMEM培養基，繼續培養；

（8）48 h后收集第一批病毒，并加入6mL新鮮DMEM培養基；

（9）72 h后收集第二批病毒，此時可用熒光顯微鏡觀察GFP熒光強度檢測轉染效率；

收集的病毒離心取上清，用0.22μm的濾膜過濾，然后進行濃縮；濃縮使用Backman超速離心機，32Ti轉子，12000 rpm×90 min，棄上清后使用200 μLX-VIVO（loza）培養基重懸，震蕩30 min后長期凍存于-80℃，并且對病毒進行滴度檢測；

取MOI=50的病毒量感染10×10⁴個T細胞，于24 孔板中離心感染，600 g×60 min，感染后將T細胞轉移至新鮮培養基中培養。

3.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權利要求1-2任一項所述CAR-T細胞；

所述藥物組合物中，權利要求1-2任一項所述CAR-T作為活性成分；

所述藥物組合物中，還具有其他抗腫瘤活性成分，所述其他抗腫瘤活性成分為包括細胞毒類藥物、激素類藥物、生物反應調節劑、單克隆抗體中一種或幾種；

所述細胞毒類藥物為烷化劑、絲裂霉素、拓撲異構酶抑制劑或微管蛋白抑制劑；

所述激素類藥物為抗雌激素、孕激素；

所述生物反應調節劑為干擾素或白細胞介素-2；

所述單克隆抗體為利妥昔單抗注射液、注射用曲妥珠單抗、或貝伐珠單抗。