[發明專利]一種蝴蝶花基因沉默體系的構建方法

在審

• 申請號: 202111024072.6
• 申請日: 2021-09-02
• 公開（公告）號: CN113736819A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 許曈;張潤龍;邵靈梅;王小斌;李丹青;張佳平;夏宜平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N15/84;C12N15/66;C12N9/02;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

本發明涉及生物技術領域，旨在提供一種蝴蝶花基因沉默體系的構建方法。本發明將TRV?VIGS系統首次應用于蝴蝶花基因功能研究。通過建立快速高效的蝴蝶花病毒介導的基因沉默系統，確定最適蝴蝶花侵染受體、最佳菌液濃度、最佳侵染部位，并采用葉背十字切割注射法對蝴蝶花植株進行侵染等，顯著提高了農桿菌侵染及基因沉默的效率，實現在基因組規模上高通量、功能性分析單子葉植物中鳶尾屬植物基因功能。本發明的基因沉默體系簡便、快速、高效，可為解析蝴蝶花重要性狀分子機制奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種蝴蝶花VIGS基因沉默體系的構建方法。

背景技術

病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是一種轉錄后基因沉默現象，可引起內源mRNA序列特異性降解，相應表型發生變異，從而可以通過植物表型或生理指標上的變化反應該基因功能。VIGS技術具有快速、高效、通量高等優點，能夠方便快捷地研究基因功能，甚至可以用來研究一些突變后會致死的基因功能，因此該技術被廣泛應用于植物生長發育、抗病蟲、代謝調控等方面功能基因研究中。

蝴蝶花(Iris japonica)為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬宿根花卉，其花葉俱佳，四季常綠，生長適應性強，從我國廣東省至陜西省均有分布，是一種良好的園林地被植物。但蝴蝶花遺傳再生相對困難，以花器官作為外植體進行愈傷組織誘導效率極低，自然結實率低且種子具休眠特性亦無法用種胚作為外植體，以地下根莖作為外植體則消毒困難，誘導效率也很低，因此利用轉基因技術驗證蝴蝶花基因功能尚存在技術瓶頸。模式植物中研究已證實：VIGS技術試驗周期短，不依賴轉基因操作，具有低成本、高通量等優點，目前該技術仍較少應用于單子葉植物中。建立以鳶尾為代表的單子葉植物VIGS技術體系，可快速有效地對該類植物關鍵基因進行功能驗證，對于解析其重要性狀分子機制具有理論和實踐意義，為實現我國花卉分子育種奠定基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種蝴蝶花基因沉默體系的構建方法。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種蝴蝶花基因沉默體系構建方法，包括下述步驟：

(1)蝴蝶花目的基因片段的克隆

根據蝴蝶花轉錄組數據注釋為目的基因的轉錄本保守區域設計酶切引物(產物長度約為200-300bp)，并在正向和反向引物5’端分別添加限制性內切酶Xba I和Sac I的識別堿基，以及保護堿基序列GCTCTAGA和CGAGCTC；

提取蝴蝶花RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增獲得目的基因片段；電泳，切膠回收PCR產物；連接pEASY-blunt載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態；37℃暗培養過夜后挑取單克隆，用載體自帶引物PCR鑒定獲得陽性克隆后，測序確認PCR產物的正確性；

(2)構建含蝴蝶花目的基因TRV載體的根癌農桿菌

提取步驟(1)中經測序驗證的含有蝴蝶花目的基因片段的PCR產物克隆載體質粒；使用Xba I和Sac I兩個限制性內切酶對該克隆載體質粒和pTRV2質粒進行酶切，酶切條件37℃、40分鐘；電泳、切膠回收目的基因和pTRV2載體酶切片段，使用T4 DNA連接酶將目的基因和pTRV2載體酶切回收片段進行連接，連接條件為16℃、3小時；

將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，37℃暗培養過夜后挑取單克隆，使用載體酶切位點兩側序列設計的引物pTRV2-F(5’-TGGGAGATGATACGCTGTT-3’，SEQ ID NO.1)和pTRV2-R(5’-CCTAAAACTTCAGACACG-3’，SEQ ID NO.2)進行陽性單克隆PCR檢測并測序；

提取獲得的陽性克隆質粒，使用凍融法轉化農桿菌GV3101，28℃暗培養兩天后挑取單克隆，使用pTRV2-F和pTRV2-R引物進行陽性單克隆PCR檢測；