[發明專利]一種蝴蝶花基因沉默體系的構建方法

在審

• 申請號: 202111024072.6
• 申請日: 2021-09-02
• 公開（公告）號: CN113736819A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 許曈;張潤龍;邵靈梅;王小斌;李丹青;張佳平;夏宜平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N15/84;C12N15/66;C12N9/02;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.一種蝴蝶花基因沉默體系的構建方法，其特征在于，包括下述步驟：

(1)蝴蝶花目的基因片段的克隆

根據蝴蝶花轉錄組數據注釋為目的基因的轉錄本保守區域設計酶切引物，并在正向和反向引物5’端分別添加限制性內切酶Xba I和Sac I的識別堿基，以及保護堿基序列GCTCTAGA和CGAGCTC；

提取蝴蝶花RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增獲得目的基因片段；電泳，切膠回收PCR產物；連接pEASY-blunt載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態；37℃暗培養過夜后挑取單克隆，用載體自帶引物PCR鑒定獲得陽性克隆后，測序確認PCR產物的正確性；

(2)構建含蝴蝶花目的基因TRV載體的根癌農桿菌

提取步驟(1)中經測序驗證的含有蝴蝶花目的基因片段的PCR產物克隆載體質粒；使用Xba I和Sac I兩個限制性內切酶對該克隆載體質粒和pTRV2質粒進行酶切，酶切條件37℃、40分鐘；電泳、切膠回收目的基因和pTRV2載體酶切片段，使用T4 DNA連接酶將目的基因和pTRV2載體酶切回收片段進行連接，連接條件為16℃、3小時；

將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，37℃暗培養過夜后挑取單克隆，使用載體酶切位點兩側序列設計的引物pTRV2-F和pTRV2-R進行陽性單克隆PCR檢測并測序；

提取獲得的陽性克隆質粒，使用凍融法轉化農桿菌GV3101，28℃暗培養兩天后挑取單克隆，使用pTRV2-F和pTRV2-R引物進行陽性單克隆PCR檢測；

(3)以農桿菌介導侵染蝴蝶花植株

將含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-報告基因、pTRV2-目的基因片段的農桿菌GV3101菌液50-100μL加入至5mL含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的Luria-Bertani培養液，放入搖床中28℃、200rpm搖菌16小時，再轉入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、10mM MES和20μM AS的150ml LB液體培養基，放入搖床中28℃、200rpm搖菌16小時；當菌液的OD₆₀₀為1.5-2.0時，4000rpm、25℃離心10分鐘收集菌體；用含有10mM MgCl₂、10mM MES、200μM AS的150ml侵染緩沖液分別重懸菌體；取含有pTRV1的農桿菌GV3101菌液與含有pTRV2的農桿菌GV3101菌液，按照體積比1:1混合以此用于參照系；取含有pTRV1的農桿菌GV3101菌液與含有pTRV2-報告基因的農桿菌GV3101菌液，按照體積比1:1混合；取含有pTRV1的農桿菌GV3101菌液與含有pTRV2-目的基因片段的農桿菌GV3101菌液，按照體積比1:1混合；25℃避光靜置活化4小時；

以混合后的農桿菌GV3101菌液分別對蝴蝶花植株進行侵染處理；將植株在濕度60％，20-21℃環境暗培養3天之后，改為在濕度60％，光照14-16小時、25℃、4000lxs/黑暗10-8小時、18℃條件繼續培養直至出現表型；

(4)基因沉默植株的檢測

首先經過一段時間觀察，記錄侵染植株形態變化；選擇其中出現預期表型的植株，提取其葉片總RNA并反轉錄成cDNA，使用pTRV2-F和pTRV2-R引物進行PCR，檢測帶目的基因的pTRV2重組載體是否進入植物體內；使用qPCR對野生型、僅轉入pTRV2空載和含目的基因-pTRV2重組載體的植株進行目的基因表達定量，其中目的基因表達量較低的植株即為基因沉默成功的植株。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述報告基因具體是指綠色熒光蛋白；所述蝴蝶花轉錄組數據注釋為目的基因的轉錄本保守區域，具體是指：蝴蝶花轉錄組數據注釋為蝴蝶花八氫番茄紅素脫氫酶PDS轉錄本保守區域。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中進行侵染處理時，所用蝴蝶花植株是苗齡為1年生植株。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中進行侵染處理時，侵染部位包括根狀莖、莖尖或葉片；其中，

(1)以根狀莖和莖尖為侵染對象時，侵染前先用1ml注射器針頭在根狀莖或莖尖扎2-3個孔，隨后將扎孔部位淹沒在侵染液中，將其放入真空泵中-0.9kg/cm²抽真空30分鐘，放氣20分鐘；

(2)以葉片為侵染對象時，先用1ml注射器針頭在蝴蝶花葉片背部輕輕劃十字，但切勿劃穿，再用去掉針頭的1ml注射器，將上述各混合液分別對準十字中心注射。