[發明專利]用于表征雙鏈靶多核苷酸的類發夾銜接子、構建體和方法

有效

• 申請號: 202111018113.0
• 申請日: 2021-09-01
• 公開（公告）號: CN113462764B
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 章益;苗卉;孫繼國;張周剛;卓遠
• 申請（專利權）人: 北京齊碳科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方億思知識產權代理有限責任公司 11258
• 代理人: 段月欣

本發明提供一種用于表征雙鏈靶多核苷酸的類發夾銜接子、構建體和方法。所述類發夾銜接子包含用于分別與所述雙鏈靶多核苷酸的模板鏈和互補鏈連接的第一單鏈和第二單鏈，所述第一單鏈與所述第二單鏈形成至少1個雙鏈核酸區用于在所述模板鏈通過跨膜孔后使所述互補鏈靠近所述跨膜孔。還提供包含上述類發夾銜接子的構建體，以及表征雙鏈靶多核苷酸的方法、試劑盒等。本發明的表征方法具有很多優勢，比如平衡靶多核苷酸的模板鏈和互補鏈的易位速度、提高測序準確率等。

技術領域

本申請屬于生物分析檢測的技術領域，具體涉及使用跨膜孔對雙鏈靶核苷酸進行表征如測序的類發夾銜接子、構建體和方法。

背景技術

目前，核酸測序技術在多個場景都有應用需求。現有的測序技術需要在前期對待測序樣品進行復雜的處理，并且測序周期長，無法滿足臨床等應用場景中對核酸測序技術快速、便捷的需要。

跨膜孔（比如納米孔）作為生物傳感器發展新的核酸測序技術具有巨大的潛力。對納米孔兩側施加電壓后，當分析物（例如核苷酸，多肽）通過納米孔時造成電流下降，不同結構的分析物所引起的電流阻斷程度不同。核苷酸納米孔可檢測分析物通過時所造成的具有已知特征和持續時間的電流阻斷。

在納米孔測序方法中，使單個多核苷酸通過孔，并直接鑒定所述核苷酸。鏈測序方法中包括一個核苷酸結合蛋白（比如解旋酶，聚合酶），以作為多核苷酸通過納米孔的分子制動器。由于納米孔的尺寸限制可能只有ssDNA可以通過孔，dsDNA在通過孔前需要解鏈以產生ssDNA。核苷酸結合蛋白（比如解旋酶，聚合酶）能夠使dsDNA解鏈，并通過易位控制多核苷酸的過孔速度。但是無論是聚合酶、解旋酶，還是外切酶，這種方法都不能對互補鏈進行測序。因此，dsDNA中只有一半的DNA信息被測序。

因此，對dsDNA的模板鏈和互補鏈同時進行測序的方法受到了廣泛關注。例如，專利CN 103827320 A公開了一種對dsDNA的模板鏈和互補鏈進行測序的方法，該方法利用專門設計的dsDNA構建體的發夾轉角。用一種發夾環橋式結構連接dsDNA的兩條鏈，使得在模板鏈過孔之后互補鏈能夠連續過孔。但是，該方法增加了樣品前處理的難度，增加了操作時間，并可能會造成珍貴樣品的損失。甚至，由發夾轉角連接的模板鏈和互補鏈容易在過孔后重新發生雜交，這會增加互補鏈過孔時的易位速度，使測序的準確率降低。

另外，專利CN110168104A公開了另一種對dsDNA的模板鏈和互補鏈進行測序的方法，該方法通過構造納米孔復合物實現測序。在納米孔上通過化學修飾連接上能夠與互補鏈的末端部分序列互補配對的核苷酸探針，當模板鏈與互補鏈解旋后過孔時，探針即可捕獲互補鏈使互補鏈停留在納米孔的附近，因此，互補鏈在模板鏈完全過孔后會存在一定的概率隨即過孔。但是，該方法需要對納米孔進行化學修飾，增加了制備工藝的復雜度；構建文庫時，需要分別連接兩組銜接子，分別做兩次純化，增加了文庫制備的復雜度，降低了文庫制備的效率。

雖然現有技術中公開了對dsDNA的模板鏈和互補鏈同時進行測序的方法，但是每種方法各有其缺陷，因此仍然需要開發更優的方法實現對dsDNA的模板鏈和互補鏈同時進行實時連續測序，以平衡雙鏈靶多核苷酸的兩條鏈的易位速度并提高測序的準確率。

發明內容

本發明人發現通過類發夾銜接子連接的雙鏈靶多核苷酸的兩條鏈而對兩條鏈進行測序具有很多優勢，比如平衡靶多核苷酸的模板鏈和互補鏈的易位速度、提高測序準確率等。

因此，本發明的第一方面涉及一種用于表征雙鏈靶多核苷酸的類發夾銜接子，所述表征雙鏈靶多核苷酸包括對所述雙鏈靶多核苷酸進行堿基序列測定或序列修飾等信息識別。所述類發夾銜接子包含用于分別與所述雙鏈靶多核苷酸的模板鏈和互補鏈連接的第一單鏈和第二單鏈，所述第一單鏈與所述第二單鏈形成至少1個雙鏈核酸區用于在所述模板鏈開始通過跨膜孔至完全通過跨膜孔后使所述互補鏈靠近所述跨膜孔。