[發(fā)明專利]用于表征雙鏈靶多核苷酸的類發(fā)夾銜接子、構(gòu)建體和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111018113.0
• 申請(qǐng)日: 2021-09-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113462764B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章益;苗卉;孫繼國(guó);張周剛;卓遠(yuǎn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京齊碳科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京東方億思知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11258
• 代理人: 段月欣

1.一種用于表征雙鏈靶多核苷酸的類發(fā)夾銜接子，所述類發(fā)夾銜接子包含用于分別與所述雙鏈靶多核苷酸的模板鏈和互補(bǔ)鏈連接的第一單鏈和第二單鏈，所述第二單鏈包含反向連接的第一區(qū)段和第二區(qū)段, 所述第一區(qū)段遠(yuǎn)離所述雙鏈靶多核苷酸的互補(bǔ)鏈，所述第二區(qū)段靠近所述雙鏈靶多核苷酸的互補(bǔ)鏈；

所述第一單鏈與所述第二單鏈形成第一雙鏈核酸區(qū)用于在所述模板鏈開(kāi)始通過(guò)跨膜孔至完全通過(guò)跨膜孔后使所述互補(bǔ)鏈靠近所述跨膜孔，所述第一核酸雙鏈區(qū)位于所述第二單鏈的所述第一區(qū)段；

所述第一單鏈與所述第二單鏈形成與所述雙鏈靶多核苷酸連接的第二雙鏈核酸區(qū)，所述第二雙鏈核酸區(qū)形成于所述第二單鏈的所述第二區(qū)段；

所述第一單鏈和所述第二單鏈還形成非互補(bǔ)區(qū)，所述第二單鏈的第二區(qū)段位于所述非互補(bǔ)區(qū)的區(qū)域包含多核苷酸結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，所述第二單鏈的第一區(qū)段位于所述非互補(bǔ)區(qū)的區(qū)域位于所述第一區(qū)段上遠(yuǎn)離第二區(qū)段的位置并用于帶動(dòng)靠近所述跨膜孔的所述互補(bǔ)鏈通過(guò)跨膜孔；

所述第一雙鏈核酸區(qū)和所述第二雙鏈核酸區(qū)的長(zhǎng)度均為20bp~50bp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類發(fā)夾銜接子，其特征在于，所述第二單鏈為3’-5’-5’-3’第二單鏈或5’-3’-3’-5’第二單鏈；其中

所述3’-5’-5’-3’第二單鏈包含3’-5’第一區(qū)段和5’-3’第二區(qū)段，所述3’-5’第一區(qū)段的5’端與所述5’-3’第二區(qū)段的5’端連接；

所述5’-3’-3’-5’第二單鏈包含5’-3’第一區(qū)段和3’-5’第二區(qū)段，所述5’-3’第一區(qū)段的3’端與所述3’-5’第二區(qū)段的3’端連接。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的類發(fā)夾銜接子，其特征在于，所述第二單鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)使用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將所述第一區(qū)段和所述第二區(qū)段反向連接形成的；或者，所述第二單鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)使用正向堿基和反向堿基直接合成的。

4.一種用于表征雙鏈靶多核苷酸的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體包含所述雙鏈靶多核苷酸和權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的類發(fā)夾銜接子，所述雙鏈靶多核苷酸在其一端與所述類發(fā)夾銜接子連接。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于表征雙鏈靶多核苷酸的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體還包含在所述雙鏈靶多核苷酸上與所述類發(fā)夾銜接子的相對(duì)端連接的至少一種聚合物；

所述至少一種聚合物包含在所述雙鏈靶多核苷酸的模板鏈上連接的前導(dǎo)聚合物，和在所述雙鏈靶多核苷酸的互補(bǔ)鏈上連接的尾部聚合物，并且所述前導(dǎo)聚合物和所述尾部聚合物形成部分互補(bǔ)雙鏈；所述前導(dǎo)聚合物包含多核苷酸結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，所述前導(dǎo)聚合物為由堿基基團(tuán)和無(wú)堿基基團(tuán)形成的單鏈，所述尾部聚合物為經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的堿基基團(tuán)形成的單鏈；

所述構(gòu)建體的兩條鏈為非共價(jià)連接。

6.一種表征雙鏈靶多核苷酸的方法，所述方法包括：

（a）提供包含具有模板鏈和互補(bǔ)鏈的雙鏈靶多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述雙鏈靶多核苷酸在其一端與權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的類發(fā)夾銜接子連接；

（b）使所述構(gòu)建體與跨膜孔和多核苷酸結(jié)合蛋白接觸；

（c）提供條件使同一所述構(gòu)建體的模板鏈和互補(bǔ)鏈依次通過(guò)跨膜孔；和

（d）測(cè)量所述雙鏈靶多核苷酸的模板鏈和互補(bǔ)鏈分別通過(guò)所述跨膜孔期間產(chǎn)生的特征。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建體如權(quán)利要求5所定義。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括使所述構(gòu)建體與第一多核苷酸結(jié)合蛋白和第二多核苷酸結(jié)合蛋白接觸，所述第一多核苷酸結(jié)合蛋白用于分開(kāi)所述構(gòu)建體的兩條鏈以及控制所述模板鏈移動(dòng)通過(guò)所述跨膜孔，所述第二多核苷酸結(jié)合蛋白用于控制所述互補(bǔ)鏈易位通過(guò)所述跨膜孔，使整個(gè)所述雙鏈靶多核苷酸被表征。