[發明專利]一種用于促進外傷愈合的臍帶間充質干細胞外用凝膠、給藥方法和應用

在審

• 申請號: 202111011722.3
• 申請日: 2021-08-31
• 公開（公告）號: CN113842398A
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 陳曉波;方芳;胡學鑫;韓洪起;韓顥;馮春玲;吳學濤
• 申請（專利權）人: 優賽生命科學發展有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/06;A61K47/36;C12N5/0775;A61P17/02;A61P29/00;A61K31/734
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種用于促進外傷愈合的臍帶間充質干細胞外用凝膠，其特征在于：制備步驟如下：

(1)將體外分離獲得的間充質干細胞以原代培養基進行細胞培養，37℃、5％CO₂培養，3-4小時后翻面，使培養基浸潤細胞，繼續培養P0代細胞7-10天；

(2)細胞融合度達到50％-70％，質量濃度0.9％氯化鈉注射液清洗細胞一次，加入胰酶消化液使細胞從培養瓶底部脫落；300-500g離心5-8分鐘，去上清，細胞沉淀用培養基重懸，過濾，計數，根據計數結果按照4-6×10³/cm²接種于細胞培養瓶或細胞培養皿中，補加完全培養基后放入37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養P1代細胞；

(3)細胞培養3-6天，細胞融合度達到50-80％，質量濃度0.9％氯化鈉注射液清洗細胞一次，加入胰酶消化液使細胞從培養瓶底部脫落；300-500g離心5-8分鐘，去上清，細胞沉淀用培養基重懸，過濾，計數，根據計數結果按照1-2×10⁴/cm²接種量將細胞接種到培養瓶中，補加完全培養基后放入37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養P2代細胞；

(4)細胞培養2-4天后，細胞融合度達到80-90％，質量濃度0.9％氯化鈉注射液清洗細胞一次，加入胰酶消化液使細胞從培養瓶底部脫落；300-500g離心5-8分鐘，去上清，細胞沉淀用培養基重懸后過濾，計數，根據計數結果，進行種子庫細胞凍存，凍存規格3-4×10⁶/ml/管；放入醫用低溫冰箱冷凍，24h后轉入液氮罐長期保存；

(5)觀察P2代種子細胞生長狀態，篩選出細胞生長狀態良好的P2代種子細胞，良好即為滿足如下的觀察指標：①細胞形態呈長梭形；②流式細胞儀測定CD29+＞95％、CD44+＞95％、CD73+＞95％、CD90+＞95％、CD105+＞95％、CD34+＜2％、CD45+＜2％、HLA-DR+＜2％；③臍帶間充質干細胞體外能夠向成脂、成骨、成軟骨細胞誘導分化；

(6)微生物檢測即需厭氧菌、真菌、支原體檢測均為陰性后，復蘇種子庫細胞，按照2-3×10⁴/cm²接種量將細胞接種到培養瓶中，補加完全培養基后放入37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養P3代細胞；

(7)培養3-4天，融合度達到80-90％，0.9氯化鈉注射液清洗細胞一次，加入胰酶消化液使細胞從培養瓶底部脫落，300-500g離心5-8分鐘，去上清，培養基重懸細胞沉淀，過濾，計數，根據計數結果，按照2-3×10⁴/cm²接種量將細胞接種到培養瓶中，補加完全培養基，放入37℃，5％CO₂培養箱中繼續培養P4代細胞；

(8)按照步驟(7)的方法將P4代細胞傳代培養至P5代后，按照步驟(4)的方法進行工作庫細胞凍存，凍存規格為1.2×10⁷/3ml/管；放入醫用低溫冰箱冷凍，24h后轉入液氮罐長期保存；

(9)海藻酸鈉凝膠配制：溶膠：在生物安全柜中，將滅菌后的海藻酸鈉粉末加入含轉子的藍蓋瓶中，再向其中依次加入丙二醇、DMSO、復方電解質注射液，邊加邊搖勻，蓋緊瓶蓋，室溫避光放置48h使其充分溶脹；溶脹48h后將藍蓋瓶放在磁力攪拌器攪拌，使海藻酸鈉粉末充分溶解，室溫避光保存，得海藻酸鈉凝膠；

其中，海藻酸鈉：丙二醇：DMSO：復方電解質注射液的比例g：ml：ml：ml為1.5-2.5：10-15：10：75-80；

(10)微生物檢測即需厭氧菌、真菌、支原體檢測均為陰性后，復蘇工作庫細胞，按照2-3×10⁴/cm²接種量將細胞接種到培養瓶中，補加完全培養基后放入37℃，5％CO₂培養箱中培養P6代細胞；

(11)細胞培養3天后，融合度達到80-90％，質量濃度0.9％氯化鈉注射液清洗細胞兩次后，加入胰酶消化液消化回收細胞，300-500g離心5-8分鐘，去上清，使用預先配制好的洗液清洗細胞三次，去上清，以20％人血白蛋白重懸細胞沉淀，過濾，計數，根據計數結果，調整細胞懸液濃度至4.5-9×10⁶/ml；

其中，洗液成分為：每500ml質量濃度0.9％氯化鈉注射液中加入1ml質量濃度20％人血白蛋白；

(12)分別將步驟(11)制得的細胞懸液與步驟(9)的海藻酸鈉凝膠按體積比1:2灌裝至預充式注射器中，顛倒混勻后放入醫用低溫冰箱冷凍保存，即得用于促進外傷愈合的臍帶間充質干細胞外用凝膠。