[發明專利]一種無支架牙周膜干細胞球及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202111009287.0
• 申請日: 2021-08-31
• 公開（公告）號: CN113755481A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 陳靜;劉月華
• 申請（專利權）人: 上海市口腔醫院（上海市口腔健康中心）
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04;C12N5/0775;A61L27/38
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其是涉及一種無支架牙周膜干細胞球及其制備方法與應用。本發明利用細胞球培養板三維培養技術，制備無支架牙周膜干細胞球并將無支架牙周膜干細胞球應用到成骨分化相關的組織工程。本發明的無支架牙周膜干細胞球具有良好的穩定性和生物活性，及較強的成骨分化效能，可用作牙周組織工程、骨組織工程領域中的細胞骨替代材料或與支架材料結合運用，提高成骨效能。通過該發明培養收集所得的無支架牙周膜干細胞球大小均勻一致，能夠維持較長時間的細胞活性；與此同時，本發明制備方法可重復，簡便易行，不需要依賴大型設備或裝置，有利于快速有效獲得細胞球結構。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其是涉及一種無支架牙周膜干細胞球及其制備方法與應用。

背景技術

目前，傳統的細胞培養以培養瓶或培養皿為代表的二維培養模式為主。該培養模式并不具備活體組織的空間形態，在培養過程中，細胞往往出現某一特定組織性質丟失的情況。在真實的人體環境中，相鄰細胞之間以及胞外基質間相互滲透溝通，形成立體的空間組織，構成復雜的生物化學信號網絡，這一結構對細胞的正常生理活動意義重大。多數情況下，二維細胞培養方法體外研究所得結果與體內實驗不相符合，一方面與細胞在體外環境下隨著傳代次數的增多逐漸喪失其原有性狀有關，另一方面也與體內實驗受到多種因素和復雜環境影響所致。為了盡可能真實地模擬細胞所處的體內微環境，越來越多的研究開始關注細胞三維培養。

研究發現，細胞球成球機理主要與細胞的黏附和分化有關，在細胞球的形成過程中整合素、鈣粘蛋白、胞外纖維等被發現或表達上調。制作細胞球的方法主要有懸滴培養(hanging drop)、利用旋轉生物反應器(rotating bioreactor)培養、無黏附表面的塑料制品培養、利用外部力量制作、改變培養基成分、微基板等方法。上述方法往往存在批量生產較困難、所獲得細胞球尺寸、數目及形態有差異、培養細胞類型有限，需專門設備成本高等問題。相對而言，細胞培養板法操作簡便，可批量生產，逐漸應用于三維細胞培養領域。該方法以瓊脂糖凝膠等為載體，利用預置尺寸的模具在6孔板、24孔板或96孔板中制作不同尺寸孔板，通過接種不同種類和數量的的細胞來制備細胞球。

牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)來源于新鮮牙周膜組織，具有很高的增殖和克隆形成能力，高表達間充質干細胞標記物STRO-1和CD146/MCU18，具備多向分化潛能，是較為理想的牙周組織再生的種子細胞來源。研究表明相較于二維培養細胞，三維培養所得的PDLSC細胞球成骨分化能力有所提高。應用三維動態微重力裝置培養PDLSCs發現，經過成骨誘導后細胞基質礦化結節有所增加，相關基因表達上調。將hPDLSCs包裹于海藻酸鈉微球中，應用生物反應器模擬體內環境觀察動態液流對PDLSCs生物活性的影響。經過14天成骨誘導后，細胞表現出更為顯著的礦化能力，結果顯示生物反應器培養有利于細胞成骨分化和礦化基質的形成。將PDLSCs接種于葡聚糖微載體，比較旋轉微重力培養環境與普通重力環境對細胞生長狀態的影響，發現在微重力環境下微載體表面細胞多呈半球形，細胞生長速度明顯加快。與普通培養方式相比，PDLSC細胞球呈現出一定的成骨趨勢。采用懸滴培養法形成牙周膜成纖維細胞球，將其與膠原/聚乙二醇膜復合，發現細胞球能黏附于膜上，免疫組化染色結果顯示細胞表達Col-I、periostin和Runx2。上述所制備的無支架牙周膜干細胞球在制備和使用過程中大多需要依賴支架材料。然而，多數支架材料的降解速度與細胞的生長分化不一定能相互協調。部分支架材料的降解產物為酸性，可能導致局部炎癥的發生。支架材料在原料及配比選擇、層次結構及降解性能等方面尚有待改善，才能更真實模擬細胞外基質環境。

發明內容