[發明專利]一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法

在審

• 申請號: 202111008984.4
• 申請日: 2021-08-31
• 公開（公告）號: CN113702345A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 孫春燕;李志紅;孫宏靖;劉妮
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 長春市恒譽專利代理事務所(普通合伙) 22212
• 代理人: 鞠傳龍

本發明公開了一種以2?氨基嘌呤(2?aminopurine，2?AP)作為熒光信號探針，結合Pb²⁺的特異性核酸適配體以及核酸外切酶I(Exo I)的檢測方法用于靈敏地檢測Pb²⁺。延長Pb²⁺特異性適配體的3’端序列，使其形成自身互補的平末端發夾結構，延長的序列中使用2?AP替換了其中一個腺嘌呤。Exo I幾乎不能水解發夾結構的核酸，2?AP嵌在雙鏈中，體系熒光很低。當體系中存在Pb²⁺時，Pb²⁺誘導該核酸形成3’端攜9個堿基序列的G?四鏈體結構，2?AP此時處于單鏈中，體系熒光上升。Exo I能夠水解該結構，2?AP游離出來，體系熒光進一步增強。Pb²⁺濃度在5?60nM范圍內與熒光回升強度(F₂?F₁)之間存在線性相關，檢出限為0.049nM。本發明靈敏度高、選擇性好，實現了對實際樣品中Pb²⁺的快速檢測。

技術領域

本發明涉及一種鉛離子高效靈敏的檢測方法，具體涉及一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法。

背景技術

鉛(Pb)是環境中含量最高、毒性最強的金屬之一，主要通過工業使用和家用物品(如鉛基顏料和電池)釋放到空氣、土壤和水中。由于鉛能夠在生物體內積累，長期接觸低水平的Pb也可能導致中毒。鉛是一種全身毒性物質，影響腎臟、胃腸道、心血管、生殖和神經系統，從而導致多種疾病，其中神經系統是最脆弱的靶器官。研究發現，兒童更容易被鉛的毒性影響身體健康，導致一系列問題。傳統的鉛離子檢測方法依賴于實驗室成熟且高靈敏度的分析技術，如原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)、原子發射光譜法(AES)和X-射線熒光光譜法(XRF)等。這些技術可以準確測定鉛離子濃度，但大多數都存在一定的局限性，如儀器龐大昂貴、設備運行成本高、需要專業的科研人員等，主要適用于實驗室分析，很難應用于現場快速檢測。因此開發簡便快速的現場檢測鉛離子的方法是很有必要的。

核酸適配體(aptamer)是1990年首次發現的短單鏈RNA或DNA序列(20-60個核苷酸長度)，具有高靈敏度、高結合親和力、高穩定性和良好的選擇性。到目前為止，適配體被開發用于檢測多種目標物，如小分子、離子、蛋白質和細胞等。Pb²⁺可以誘導設計的富含G的DNA序列轉化為穩定的G-四鏈體構型，具有約10^-6mol的高親和常數。

2-氨基嘌呤(2-aminopurine，2-AP)是腺嘌呤的類似物，可以取代腺嘌呤而不破壞DNA的結構，并與胸腺嘧啶形成穩定的配對。游離的2-AP具有較強的熒光信號，2-AP嵌入單鏈DNA時，由于堿基堆積相互作用，其熒光被猝滅，而嵌有2-AP的單鏈DNA與其互補鏈結合形成雙螺旋結構時，熒光被進一步猝滅。基于2-AP構建的檢測方法避免了標記額外的猝滅劑。此外，考慮到2-AP嵌入在DNA序列中，因此受到相鄰堿基的保護，有望具有更強的抗干擾能力。

近年來，為了提高檢測方法的靈敏度，研究人員開發了許多生物和化學信號放大策略，常見的包括雜交鏈式反應(hybridization chain reaction，HCR)、滾環擴增(rolling circle amplification，RCA)、核酸工具酶輔助反應和基于納米材料的反應等。與其他信號放大策略相比，核酸工具酶輔助信號放大策略具有許多突出的優點：(1)核酸工具酶對底物具有高效的催化作用，因此可以保證靈敏度；(2)所涉及的酶的反應條件溫和；(3)部分核酸工具酶具有序列特異性或底物偏好性，利于設計新的檢測方法；(4)來源于活細胞的核酸工具酶在生化分析中表現出更好的生物相容性。核酸外切酶I(Exo I)是一種與序列無關的酶，能夠從3’端到5’端降解單鏈DNA，裂解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，但不能催化雙鏈DNA的水解。

本發明利用核酸適配體作為識別探針，2-氨基嘌呤作為熒光探針，結合酶切信號放大技術，構建了一種檢測方法，實現了對鉛離子的高效靈敏檢測。

發明內容