[發明專利]一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法

在審

• 申請號: 202111008984.4
• 申請日: 2021-08-31
• 公開（公告）號: CN113702345A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 孫春燕;李志紅;孫宏靖;劉妮
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 長春市恒譽專利代理事務所(普通合伙) 22212
• 代理人: 鞠傳龍

1.一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，包括修飾了2-氨基嘌呤的DNA序列和核酸外切酶，DNA中的部分序列可與目標物特異性結合，作為熒光基團的2-氨基嘌呤能夠將DNA識別目標物及核酸外切酶酶切DNA所產生的變化轉換為易觀察的熒光信號。

2.如權利要求1所述的一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，本發明使用的這條DNA鏈包括Pb²⁺的特異性適配體、2-氨基嘌呤以及在適配體的3’端延長的9個堿基序列；

所述DNA序列如SEQ No.1所示。

3.如權利要求1所述的一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，核酸外切酶為Exo I。

4.如權利要求1-3所述的一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，用于檢測鉛離子的熒光分析。

5.如權利3所述的一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)制備Exo I的10x反應緩沖液：670mM甘氨酸-KOH，pH 9.5，25℃，67mM MnCl₂，10mMDTT；

(2)繪制標準曲線：在多個1.5mL離心管中分別加入25μL不同濃度的Pb²⁺標準溶液、25μL核酸鏈DNA,1μM混勻，混合后的溶液靜置在90℃恒溫金屬浴中加熱10min，使DNA解旋，然后在25℃金屬浴條件下緩慢降至室溫，繼續靜置反應15min，使解旋后的DNA與Pb²⁺結合形成3’端攜9個堿基序列的G-四鏈體結構；隨后加入7μL 10x反應緩沖液和2μL濃度為1U/μL的ExoI，再加11μL超純水將體系補齊至70μL，在37℃金屬浴中靜置反應35min，最后用超純水將體系補齊至500μL進行熒光測量；以鉛離子濃度作為橫坐標，鉛離子引起的體系熒光強度回升值F₂-F₁作為縱坐標，建立了該檢測方法的標準曲線，其中F₂、F₁分別表示體系中有無Pb²⁺時的熒光強度值。

6.如權利要求4所述的一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，標準曲線檢測步驟使用激發波長為310nm進行熒光檢測，最佳發射波長位于370nm處。

7.如權利要求4所述的一種基于2-氨基嘌呤和酶切放大技術檢測鉛離子的方法，其特征在于，標準曲線檢測步驟熒光發射光譜的掃描范圍設置在350-450nm之間。