[發(fā)明專利]一種快速檢測水中吡蟲啉的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111004090.8
• 申請日: 2021-08-30
• 公開（公告）號: CN113702344A
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉聰;顧春梅;施漢昌;楊海洋;宋保棟
• 申請（專利權(quán)）人: 北京協(xié)同創(chuàng)新研究院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533;G01N33/53
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 姚曉麗

1.一種快速檢測水中吡蟲啉的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：制備吡蟲啉生物傳感元件

取生物傳感元件，進行表面羥基化處理，得到表面羥基化的生物傳感元件；

將表面羥基化的生物傳感元件進行表面烷基化處理，得到表面烷基化的生物傳感元件；

將表面烷基化的生物傳感元件連接雙功能交聯(lián)劑，得到連接雙功能交聯(lián)劑的生物傳感元件；

在連接雙功能交聯(lián)劑的生物傳感元件的反應(yīng)位點上，進行吡蟲啉包被抗原的固定，得到固定有吡蟲啉包被抗原的生物傳感元件；

將固定有吡蟲啉包被抗原的生物傳感元件的未反應(yīng)位點進行封閉，得到吡蟲啉生物傳感元件；

步驟2：制備熒光標記的吡蟲啉抗體

將吡蟲啉抗體進行初步透析，得到初步透析后的吡蟲啉抗體；

將初步透析后的吡蟲啉抗體與熒光染料進行反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；

將反應(yīng)溶液進行二次透析，得到熒光標記的吡蟲啉抗體；

步驟3：建立標準曲線

在倏逝波熒光生物傳感器中，以PBS緩沖液作為空白對照，與步驟2得到的熒光標記的吡蟲啉抗體混合后，進行預(yù)反應(yīng)，再在步驟1得到的吡蟲啉生物傳感元件表面進行反應(yīng)，讀取空白熒光信號值；

將濃度梯度的吡蟲啉標準工作溶液與步驟2得到的熒光標記的吡蟲啉抗體混合后，進行預(yù)反應(yīng)，再在步驟1得到的吡蟲啉生物傳感元件表面進行反應(yīng)，讀取吡蟲啉標準工作溶液的熒光信號值；

以吡蟲啉標準工作溶液的熒光信號值與空白熒光信號值的比值為縱坐標，以吡蟲啉標準工作溶液的濃度為橫坐標，得到標準曲線；

步驟4：待測水樣中吡蟲啉含量的檢測

取待測水樣，與步驟2得到的熒光標記的吡蟲啉抗體混合后，進行預(yù)反應(yīng)，再在步驟1得到的吡蟲啉生物傳感元件表面進行反應(yīng)，讀取待測水樣的熒光信號，并與步驟3得到的空白熒光信號值進行歸一化處理，代入步驟3得到的標準曲線中，得到待測水樣中吡蟲啉的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測水中吡蟲啉的方法，其特征在于，步驟1中，所述生物傳感元件為生物芯片或光纖傳感器；所述表面羥基化處理的方法是：將生物傳感元件浸入到Piraha溶液中，于100℃-120℃加熱反應(yīng)60min，然后用超純水清洗至清洗液的pH值為7，在室溫下用氮氣吹干，得到表面羥基化的生物傳感元件；

所述表面烷基化處理的方法是：將表面羥基化的生物傳感元件浸入到3-巰基丙基三甲氧基硅烷溶液的無水甲苯溶液中，于20℃-25℃，反應(yīng)2h，得到表面烷基化的生物傳感元件；

所述連接雙功能交聯(lián)劑的方法是：將表面烷基化的生物傳感元件用無水甲苯清洗3-5次，在無塵空氣條件下用氮氣吹干，然后放入濃度為2mmol/L的N-琥珀酰亞胺基-4-馬來酰亞胺丁酸酯溶液中，反應(yīng)1h后取出，先用無水乙醇沖洗3次，再用高純水沖洗干凈，然后用氮氣吹干，得到連接雙功能交聯(lián)劑的生物傳感元件。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測水中吡蟲啉的方法，其特征在于，步驟1中，所述吡蟲啉包被抗原的固定的具體方法是：將5μL-10μL的1mg/mL-4mg/mL吡蟲啉包被抗原溶液滴加到連接雙功能交聯(lián)劑的生物傳感元件的反應(yīng)位點上，于4℃下放置12h后，將多余的吡蟲啉包被抗原溶液吸干凈，再用超純水沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到固定有吡蟲啉包被抗原的生物傳感元件；

所述封閉的具體方法是：室溫下，采用濃度為用2mg/mL的牛血清白蛋白，將固定有吡蟲啉包被抗原的生物傳感元件的未反應(yīng)位點封閉60min，然后用超純水沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到吡蟲啉生物傳感元件。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測水中吡蟲啉的方法，其特征在于，步驟2中，所述初步透析的方法是：在透析袋中，將吡蟲啉抗體置于pH值為9.0-9.3，濃度均為0.1mol/L的碳酸鈉和碳酸氫鈉按體積比為1:9的混合液中，透析2h，得到初步透析后的吡蟲啉抗體；

所述初步透析后的吡蟲啉抗體與熒光染料進行反應(yīng)的具體方法是：將初步透析后的吡蟲啉抗體與熒光染料Cy5.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯按摩爾比為1:15，于37℃反應(yīng)2h，得到反應(yīng)溶液。