[發(fā)明專利]一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌的引物、探針和試劑盒及其應用

有效

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• 申請日: 2021-08-30
• 公開（公告）號: CN113444826B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設計）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權）人: 至善時代智能科技（北京）有限公司;至微生物智能科技（廈門）有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發(fā)明提供了一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌的引物、探針和試劑盒及其應用，屬于環(huán)境細菌檢測與鑒定技術領域。一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。所述引物僅能對微球菌屬內物種準確擴增，而對屬外物種無法擴增，因此，所述引物對微球菌屬內物種具有較強的擴增特異性。本發(fā)明還提供了一種鑒定環(huán)境中微球菌的方法，通過熒光等溫擴增技術，對環(huán)境中微球菌進行快速鑒定，操作簡單，對微球菌鑒定范圍廣，且對微球菌的最低檢測限可達60fg/μL，具有較高的檢測靈敏度。

技術領域

本發(fā)明屬于環(huán)境細菌檢測與鑒定技術領域，具體涉及一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌的引物、探針和試劑盒及其應用。

背景技術

微球菌屬于革蘭氏陽性菌，是條件致病菌，能在極端環(huán)境下生長，且在一定條件下可引起皮膚局部組織感染，甚至嚴重感染，造成心內膜炎等疾病。微球菌屬有多個分類，其不同的分類在不同的領域有不同的應用。在不同的條件下，不同的微球菌種類可能會對人類生活造成或好或壞的影響，而無論是為了對微球菌的預防還是利用，都需要合適的方法對其進行檢測和鑒定。

16S rDNA基因是細菌中編碼rRNA的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中，具有良好的進化保守性以及與進化距離相匹配的變異性，是細菌分子鑒定的標準標識序列。隨著PCR技術的出現及核酸研究技術的不斷完善，16S rDNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具，應用該技術可以實現對病原菌進行快速、微量、準確簡便的分類鑒定和檢測。

等溫擴增技術是近年來發(fā)展起來的新型核酸擴增技術，該技術可以在恒定溫度下快速有效地擴增核酸序列。與需要復雜的熱循環(huán)以介導變性，退火和隨后的延伸的PCR方法相比，等溫擴增可以在恒溫條件下利用重組酶、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶實現對雙鏈DNA的解鏈、復性和延伸，在5~30分鐘即可完成DNA擴增，操作簡單，反應時間短，可用于對細菌的快速檢測。

目前，還沒有利用等溫擴增技術在屬水平鑒定環(huán)境微球菌的方法，現有方法主要是利用PCR技術對藤黃微球菌的鑒定，鑒定范圍小，技術要求高，靈敏度低，不利于推廣。因此，提供一種基于等溫擴增技術鑒定環(huán)境微球菌的引物、探針和方法具有十分重要的意義。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌的引物，能夠特異性鑒定微球菌屬物種，且具有檢測靈敏度高的特點。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測環(huán)境中微球菌的試劑盒及其應用，具有鑒定范圍大、技術要求低的特點，有利于推廣應用。

本發(fā)明提供了一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌的引物，包括核苷酸序列如SEQID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

本發(fā)明提供了一種基于等溫擴增技術鑒定微球菌屬的引物探針組，包括所述引物和標記有熒光基團和淬滅基團的探針；

所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明提供了一種鑒定環(huán)境中微球菌的試劑盒，包括所述引物或所述引物探針組。

優(yōu)選的，所述試劑盒包括檢測試劑；

所述檢測試劑包括recA重組酶蛋白、SSB 蛋白、Bsu DNA聚合酶、核酸外切酶III、2×反應緩沖液。

優(yōu)選的，所述2×反應緩沖液包括以下濃度的組分：200mmol/L的Tricine、220mmol/L 醋酸鎂、10mmol/L 二硫蘇糖醇、10% PEG、6mmol/L ATP、200ng/μL 肌酸激酶和20mmol/L dNTP。

優(yōu)選的，所述試劑盒包括采樣液、基因組DNA提取試劑。

本發(fā)明提供了所述引物、所述引物探針組、所述試劑盒在鑒定環(huán)境中微球菌中的應用。