[發明專利]一種化學修飾的木聚糖酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110992324.8
• 申請日: 2021-08-27
• 公開（公告）號: CN113621596A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 馬江鋒;姜岷;王寅竹;吳昊;董維亮
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/70;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 王斌

本發明公開了一種化學修飾的木聚糖酶及其制備方法和應用，屬于酶工程領域。利用NaIO₄的氧化特點，將右旋糖酐上的羥基氧化為醛基后對木聚糖酶進行化學修飾。修飾后的酶擁有右旋糖酐結構，可以與木質纖維素中纖維素結合，達到一種固定化作用，從而使酶活力提高了237%，同時擁有更高的最大反應速率Vmax，該方法克服了木聚糖酶在木質纖維素中反應速率低的缺點，提高了木聚糖酶的催化活性，具有廣闊的工業應用前景。

技術領域

本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種化學修飾的木聚糖酶及其制備方法和應用。

背景技術

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是除纖維素之外自然界最為豐富的多糖。木聚糖主鏈是由β-D-毗喃木糖殘基通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚物。植物中的木聚糖位于木質素和纖維素之間，木聚糖和木質纖維的其它成分之間存在著不同程度的相互作用。木聚糖主要以共價鍵與木質素相連接，以非共價鍵與纖維素作用。木質纖維素降解的難點之一就是由于其復雜的結構導致降解困難，因此通過對木聚糖酶進行化學修飾，使其與右旋糖酐相連，使其能夠與纖維素結合，達到一種固定化的作用，從而提高親和性，促進木質纖維素的降解。雖然酶的化學修飾可以改變酶的某些性質，提高其使用效率，但在修飾過程中往往會破壞酶分子的結構，降低了酶的活性，所以需要對酶的化學修飾條件進行優化，包括修飾時間、溫度和pH，以降低酶活性的損失。

發明內容

本發明提供一種化學修飾的木聚糖酶及其制備方法和應用，本發明合理設計并優化了修飾方法，克服了現有技術的不足，用該方法化學修飾的木聚糖酶對纖維素具有較高的親和性，提高了木質纖維素的降解效果。

本發明的第一個目的是提供一種化學修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼基因如SEQ ID NO:2所示，化學修飾劑為右旋糖酐。

進一步的，所述化學修飾劑為含有醛基的右旋糖酐，與木聚糖酶通過氨基酸的氨基進行偶聯。

進一步的，所述含有醛基的右旋糖酐采用NaIO4氧化右旋糖酐的鄰羥基獲得。

進一步的，所述含有醛基的右旋糖酐采用150kDa的右旋糖酐。步驟如下：將木聚糖酶編碼基因片段和表達載體pET28a(+)相連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌BL21，獲得重組菌株；培養重組菌株，誘導表達；發酵液破碎離心后鹽析純化，獲得所述木聚糖酶的酶液。

本發明的第二目的是提供化學修飾的木聚糖酶的制備方法，包括如下步驟：

(1)木聚糖酶的制備

將木聚糖酶編碼基因與表達載體pEt28a(+)相連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌BL21(DE3)細胞，獲得重組菌株；培養重組菌株進行發酵表達，發酵液破碎離心后，將上清液進行硫酸銨沉淀、離子交換柱純化，獲得木聚糖酶液。

(2)含醛基右旋糖酐的制備

避光下將2.4g NaIO₄溶于10mL純水制得NaIO₄溶液，將其倒入10mL濃度為2g/mL的右旋糖酐溶液中，室溫下避光攪拌8h。反應完成后加入5mL的乙二醇反應2h后，反應液在8000-14000的透析袋中，過夜透析。

(3)木聚糖酶化學修飾物的制備

本發明的第三目的是提供上述化學修飾的木聚糖酶的應用，用于木質纖維素快速降解。

本發明的有益技術效果是：與未修飾的木聚糖酶相比，修飾后的木聚糖酶和纖維素具有了一定的結合力，達到一種固定化作用，從而使其在木質纖維素的分解過程中具有更高的反應速率，同時其米氏方程的Km下降，表明與木聚糖的親和力也得到增加。

附圖說明

圖1不同時間下修飾反應后的酶活檢測

圖2不同pH下修飾反應后的酶活檢測