[發(fā)明專利]一種人腎足細胞的制備方法

有效

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• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113684174B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發(fā)明（設計）人: 李亞峰;支文強;史淑紅;王倩;韓重陽;李榮山
• 申請（專利權）人: 山西省人民醫(yī)院;李亞峰
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京知匯林知識產權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 楊華

本發(fā)明屬于生物化學技術領域，提供一種人腎足細胞的制備方法。本發(fā)明方法制得的人腎足細胞符合人腎臟足細胞標記物的表達結果，同時本方法重復性好、操作簡單，且可以獲得產量高，增值率較高且純度高的人腎臟足細胞。

技術領域

本發(fā)明屬于生物化學技術領域，尤其涉及一種人腎臟足細胞的制備方法。

背景技術

腎臟是人體的重要器官，用于清除體內代謝產物及重吸收功能物質，從而保證機體內環(huán)境的穩(wěn)定性。足細胞(podocyte)，即腎小囊臟層上皮細胞，它附著于腎小球基底膜(GBM)的外側，連同血管內皮細胞和腎小球基膜一起構成了腎小球血液濾過屏障。足細胞具有促進腎小球的發(fā)育、對抗腎小球內壓力、維持血管袢形態(tài)、調節(jié)腎小球濾過率、產生VEGF調控內皮細胞、參與炎癥和免疫反應、合成與分解腎小球基底膜等功能。常見的足細胞病有IgAN、LN、DKD、MN、FSGS(局灶性節(jié)段性腎小球硬化)、MCD(微小病變腎病)等。

足細胞特殊的解剖位置，使得其體內研究較為困難；又由于正常成年機體的腎臟足細胞是一種終末分化細胞，在成熟狀態(tài)下的足細胞增殖能力低，分化出的突觸相互交叉形成隔膜用于過濾，為了闡明這些突觸蛋白質發(fā)揮作用的功能途徑，并進一步理解其內在細胞機制，足細胞細胞培養(yǎng)實驗將變得越來越重要。足細胞體外培養(yǎng)實驗有助于確定足細胞在腎相關疾病中對腎功能的作用。足細胞體外培養(yǎng)，細胞形態(tài)由增殖期的鵝卵石轉化為分化期的樹狀細胞，樹狀細胞的分化表現(xiàn)在突觸素(synaptopodin)的表達上。足細胞特異性WT-1蛋白的表達僅限于成人腎臟中的足細胞，Nephrin是一種跨膜蛋白，位于足細胞縫隙隔膜；Podocin是NPHS2基因的蛋白產物，在分化的足細胞中可以檢測到。用手動分離的腎小球產量太小，無法進行傳代培養(yǎng)或生物測定。

有鑒于此，提出本發(fā)明。

發(fā)明內容

現(xiàn)有技術普遍存在的技術問題是腎足細胞難于分離培養(yǎng)，為解決該技術問題，本發(fā)明首要的目的是尋求一種產量高、純度高且操作簡單的腎足細胞制備方法。在本研究中，應用了磁珠和膠原酶分離的方法來提高了腎足細胞產率。具體技術方案如下。

本發(fā)明首先提供現(xiàn)有技術普遍存在的技術問題是腎足細胞難于分離培養(yǎng)，為解決該技術問題，本發(fā)明首要的目的是尋求一種產量高、純度高且操作簡單的腎足細胞制備方法。在本研究中，應用了磁珠和膠原酶分離的方法來提高了腎足細胞產率。具體技術方案如下。

本發(fā)明首先提供一種人腎足細胞的制備方法，所述方法包括如下步驟：

1)人腎臟單細胞的消化分離：取離體腎臟組織加入混合消化酶進行消化分離得單細胞懸液；所述混合消化酶中包含colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明質酸酶；

2)人腎臟足單細胞的分選：所述分選采用足細胞細胞標記物抗體結合足細胞表面標記蛋白，通過能偶聯(lián)FITC的納米磁珠，進行人腎臟足細胞的分選。

3)人腎臟足細胞的培養(yǎng)：所述培養(yǎng)包括原代增值培養(yǎng)和傳代增殖培養(yǎng)。

進一步的，所述步驟1)混合消化酶中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明質酸酶的濃度分別為0.5-2mg/mL、0.0625-0.5mg/mL、0.125-0.5mg/mL、0.025-0.5mg/mL和0.025-0.5mg/mL。

進一步的，所述步驟1)為：取離體腎臟組織剪碎后，加入相應體積的混合酶消化10-20min，用FBS終止消化；過細胞篩離心去上清，得到單細胞。

進一步的，所述步驟1)具體為：取離體腎臟組織剪碎后，加入相應體積的混合酶(優(yōu)選的，所述混合酶中各組分最優(yōu)濃度為0.5mg/mL?colⅡ+0.0625mg/mL?colIV+0.125mg/mL?colⅠ+0.025mg/mL?DNaseⅠ+0.025mg/mL?Hyaluronidase)，消化10-20min，用10％FBS終止消化，過70μm細胞篩，離心去上清，得到單細胞；用EGM-MV培養(yǎng)基+20％FBS重懸單細胞并培養(yǎng)。