[發(fā)明專利]一種人腎足細(xì)胞的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110991835.8
• 申請(qǐng)日: 2021-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113684174B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李亞峰;支文強(qiáng);史淑紅;王倩;韓重陽(yáng);李榮山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山西省人民醫(yī)院;李亞峰
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 北京知匯林知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11794
• 代理人: 楊華

1.一種人腎足細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1）人腎臟單細(xì)胞的消化分離：取離體腎臟組織加入混合消化酶進(jìn)行消化分離得單細(xì)胞懸液；所述混合消化酶中包含colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明質(zhì)酸酶；所述混合消化酶中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明質(zhì)酸酶的濃度分別為0.5-2mg/mL、0.0625-0.5mg/mL、0.125-0.5mg/mL、0.025-0.5mg/mL和0.025-0.5mg/mL；

2）人腎臟足單細(xì)胞的分選：步驟1）單細(xì)胞懸液培養(yǎng)一周后，用0.25%胰酶消化，10%?FBS終止消化，細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)約1×10⁸個(gè)細(xì)胞時(shí)，加入1mL?EasySep??Buffer重懸到EP管中，加入100uL?FcR?blocker混勻，加入3μL?FITC-Nephrin抗體到細(xì)胞中，室溫放置15-20min，加入100μL?Selection?Cocktail室溫孵育15-20min，加入?50μL?RapidSpheres??室溫孵育10-20?min；加入EasySep??Buffer?到?2.5?mL，磁力架上室溫孵育5-8min，去除上清液；再加入EasySep??Buffer?2.5?mL，孵育5-8min，去除上清；隨后在含有20%?FBS?的EGM-MV培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；

3）人腎臟足細(xì)胞的培養(yǎng)：包括原代增殖培養(yǎng)和傳代增殖培養(yǎng)；

所述原代增殖培養(yǎng)采用以1:1進(jìn)行混合的1640完全培養(yǎng)基與含20%FBS的EGM-MV培養(yǎng)基；所述傳代增殖培養(yǎng)采用含有20%?FBS、IFN-γ和雙抗的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或含有10?%FBS、IFN-γ、Human?Vegf?ITS-A和雙抗的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為細(xì)胞傳代增殖培養(yǎng)基。

2.權(quán)利要求1所述的人腎足細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟1）中，所述取離體腎臟組織加入混合消化酶進(jìn)行消化分離得單細(xì)胞懸液，具體為：取離體腎臟組織剪碎后，加入相應(yīng)體積的混合酶消化10-20min，用10%?FBS終止消化，過(guò)70μm細(xì)胞篩，離心去上清，得到單細(xì)胞；用含有20%?FBS的?EGM-MV培養(yǎng)基重懸單細(xì)胞并培養(yǎng)。

3.權(quán)利要求1所述的人腎足細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟3）中所述傳代增殖培養(yǎng)后，進(jìn)一步包括分化培養(yǎng)，所述分化培養(yǎng)基為傳代增殖培養(yǎng)基中去掉IFN-γ組分。