[發明專利]用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物及其應用

在審

• 申請號: 202110991673.8
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113604504A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 李奎;牟玉蓮;徐長江;劉志國
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/11;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 徐樂

本發明涉及生物技術領域，具體而言，提供了一種用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物及其應用。本發明提供的用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物，包括靶向酶切載體1、靶向酶切載體2和雙鏈donor序列。改造后的pAPN基因可以有效抵抗TGEV感染，同時其蛋白生理活性功能不受影響，具有適用范圍廣、基因編輯效率高等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物及其應用。

背景技術

豬傳染性腸胃炎(transmissible gastroenteritis of pigs,TGE)是由傳染性腸胃炎病毒引起的急性、高度接觸性胃腸道傳染病。各年齡的豬均能感染，十日齡以內的仔豬最易感染，七日齡以內的仔豬感染發病死亡率可達100％。

pAPN蛋白被認為是TGEV(transmissible gastroenteritis virus)進入細胞的關鍵受體。至今，已有多個單位成功制備出了pAPN基因敲除豬，且攻毒實驗證實pAPN基因敲除可完全抵抗TGEV感染。但是，除了在介導TGEV入侵方面發揮著重要作用外，pAPN在小腸中還發揮水解肽、酰胺等結構中的酰胺鍵，從而釋放不同的N-中性氨基酸的作用。同時pAPN蛋白在其他組織中還參與很多重要的生理過程，例如細胞生長、免疫調節和血壓調節。因此直接對pAPN進行敲除可能影響機體的其他生理功能。

因此，開發一種既能夠抵抗TGEV感染、又能保持pAPN蛋白正常生理功能的基因編輯豬尤為重要，在豬抗病育種方面具有重要的科學和實際意義。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物。

本發明的第二目的在于提供含有上述組合物的產品。

本發明的第三目的在于提供一種pAPN基因16外顯子定點修飾的細胞及其制備方法。

本發明的第四目的在于提供一種用于豬pAPN基因16外顯子定點修飾的方法。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物，所述組合物包括靶向酶切載體1、靶向酶切載體2和雙鏈donor序列；

所述靶向酶切載體1用于表達核酸內切酶和pAPN-sgRNA-1，所述靶向酶切載體2用于表達核酸內切酶和pAPN-sgRNA-2；

雙鏈donor序列用于替換編碼pAPN基因第736位氨基酸的密碼子，將N736替換為A736；

編碼pAPN基因第736位氨基酸的密碼子位于pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2的靶向位點之間。

進一步地，編碼pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

優選地，編碼pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

進一步地，將N736替換為A736的方案為將AAC替換為GCT；

優選地，所述雙鏈donor序列如SEQ ID NO：3所示。

進一步地，靶向酶切載體1和靶向酶切載體2的載體骨架均獨立地為CRISPR質粒；

優選地，所述CRISPR質粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，優選為CRISPR/Cas9；