[發明專利]用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物及其應用在審
| 申請號： | 202110991673.8 | 申請日： | 2021-08-26 |
| 公開（公告）號： | CN113604504A | 公開（公告）日： | 2021-11-05 |
| 發明（設計）人： | 李奎;牟玉蓮;徐長江;劉志國 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/113;C12N15/11;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463 | 代理人： | 徐樂 |
| 地址： | 100193 *** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 用于 papn 基因 16 外顯子 定點 修飾 組合 及其 應用 | ||
1.一種用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物，其特征在于，所述組合物包括靶向酶切載體1、靶向酶切載體2和雙鏈donor序列；
所述靶向酶切載體1用于表達核酸內切酶和pAPN-sgRNA-1，所述靶向酶切載體2用于表達核酸內切酶和pAPN-sgRNA-2；
雙鏈donor序列用于替換編碼pAPN基因第736位氨基酸的密碼子，將N736替換為A736；
編碼pAPN基因第736位氨基酸的密碼子位于pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2的靶向位點之間。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，編碼pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；
優選地，編碼pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，將N736替換為A736的方案為將AAC替換為GCT；
優選地，所述雙鏈donor序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根據權利要求1-3任一項所述的組合物，其特征在于，靶向酶切載體1和靶向酶切載體2的載體骨架均獨立地為CRISPR質粒；
優選地，所述CRISPR質粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，優選為CRISPR/Cas9；
優選地，所述CRISPR/Cas9質粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，優選為pX458。
5.含有權利要求1-4任一項所述的用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物的產品；
優選地，所述產品為試劑盒。
6.一種pAPN基因16外顯子定點修飾的細胞的制備方法，其特征在于，將權利要求1-4任一項所述的用于pAPN基因16外顯子定點修飾的組合物轉入目標細胞中，得到pAPN基因16外顯子定點修飾的細胞。
7.根據權利要求6所述的細胞的制備方法，其特征在于，所述細胞包括豬成纖維細胞，優選為豬胎兒成纖維細胞；
優選地，轉入方法包括電穿孔法或脂質體轉染法；
優選地，在載體組合物轉入細胞后，還包括篩選和鑒定的步驟；
優選地，所述篩選為流式分選；
優選地，所述鑒定包括測序鑒定。
8.通過權利要求6或7所述的制備方法制備得到的細胞。
9.一種用于豬pAPN基因16外顯子定點修飾的方法，其特征在于，將權利要求8所述的細胞移植入去核的卵母細胞，得到重組克隆胚胎，將所述重組克隆胚胎移植入母體內經妊娠，獲得pAPN基因16外顯子定點修飾的基因編輯豬；
或者通過顯微注射的方法，將含有權利要求1-4任一項所述的組合物顯微注射到豬合子期胚胎中，得到pAPN基因修飾胚胎，將所述基因修飾胚胎移植入母體內經妊娠，獲得pAPN基因16外顯子定點修飾的基因編輯豬。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，基因編輯豬出生后還包括鑒定的步驟；
優選地，所述鑒定包括測序鑒定。
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