[發明專利]Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202110990061.7
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113678789A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 鄭永霞;劉杰;王金麗;劉志丹;丁寶月;詹淑玉;潘巍巍;王曉敏
• 申請（專利權）人: 嘉興學院;嘉興市中醫醫院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種pUC57kan?T7重組質粒的構建法，包括以下步驟：根據小鼠miR?379/410基因簇兩端的序列，針對基因簇的兩端設計gRNA；引物退火形成的雙鏈克隆入pUC57kan?T7載體，得到pUC57kan?T7重組質粒。本發明還同時公開了利用CRISPR技術構建miR?379/410基因簇條件性敲除模型的方法：將pUC57kan?T7重組質粒進行體外轉錄，獲得sgRNA；基于PMD?18T質粒，構建包含5’端同源臂的donor重組質粒；基于PMD?18T質粒，構建包含3’端同源臂的donor重組質粒；構建miR?379/410CKO。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，更具體地，本發明涉及應用CRISPR/Cas9技術建立Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其構建方法。

背景技術

小鼠12號染色體上存在著Dlk1/Dio3印記區域，該印記區域跨度為830kb，包括3個編碼蛋白的父系表達基因(Dlk1，Rtl1和Dio3)以及若干母系表達的非編碼RNA(包括Dio3、Rian、Mirg、anti-Rtl1、Irm、Meg8)。Mirg主要分為兩個主要區域，分別是源自Rtl1轉錄本的miR-127/miR-136簇和miR-379/410簇。其中，miR-379/410簇是胎盤哺乳動物中已知最大的miRNA簇，并且在脊椎動物中保守，然而miR-379/410簇的功能尚不明確，值得進一步研究。構建基因敲除動物模型是研究Dlk1-Dio3印記區域生物學功能過程中急需解決的問題。

目前有關miR-379/410簇的功能報道的比較少，僅有2篇文獻，都是基于MiR-379/miR-410簇全身敲除的小鼠。其中一篇研究顯示：MiR-379/miR-410簇敲除的小鼠大腦興奮性突觸傳遞增加以及海馬中離子型谷氨酸受體復合物過度表達，小鼠的社交行為被過度激活。另有1篇文章研究，miR-379/410簇基因敲除的部分新生兒小鼠由于肝臟內大量代謝基因的表達失調引起了脂質代謝和葡萄糖代謝的異常，從而在出生后不久就死亡了，提示miR-379/410簇的全身敲除有一定的致死性風險。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種應用CRISPR/Cas9技術建立Mir-379/410基因簇條件性敲除小鼠模型及其構建方法。

為實現上述目的，本發明提供一種pUC57kan-T7重組質粒的構建法，包括以下步驟：

①、根據小鼠miR-379/410基因簇兩端的序列，針對基因簇的兩端設計gRNA，5’端設計的gRNA為gRNA1和gRNA2；3’端設計的gRNA為gRNA3和gRNA4：

gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG

gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG

gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG

gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG

②、引物退火(gRNA1和gRNA2退火，gRNA3和gRNA4退火)形成的雙鏈克隆入pUC57kan-T7載體，得到pUC57kan-T7重組質粒。

本發明還同時提供了一種利用CRISPR技術構建miR-379/410基因簇條件性敲除模型的方法，包括以下步驟：

1)、將pUC57kan-T7重組質粒進行體外轉錄，獲得sgRNA；

2)、基于PMD-18T質粒，構建包含5’端同源臂的donor重組質粒；

3)、基于PMD-18T質粒，構建包含3’端同源臂的donor重組質粒；

4)、構建miR-379/410 CKO。