[發明專利]Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202110990061.7
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113678789A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 鄭永霞;劉杰;王金麗;劉志丹;丁寶月;詹淑玉;潘巍巍;王曉敏
• 申請（專利權）人: 嘉興學院;嘉興市中醫醫院
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.pUC57kan-T7重組質粒的構建法，其特征在于包括以下步驟：

①、根據小鼠miR-379/410基因簇兩端的序列，針對基因簇的兩端設計gRNA，5’端設計的gRNA為gRNA1和gRNA2；3’端設計的gRNA為gRNA3和gRNA4：

gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG

gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG

gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG

gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG

②、引物退火形成的雙鏈克隆入pUC57kan-T7載體，得到pUC57kan-T7重組質粒。

2.利用CRISPR技術構建miR-379/410基因簇條件性敲除模型的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)、將pUC57kan-T7重組質粒進行體外轉錄，獲得sgRNA；

2)、基于PMD-18T質粒，構建包含5’端同源臂的donor重組質粒；

3)、基于PMD-18T質粒，構建包含3’端同源臂的donor重組質粒；

4)、構建miR-379/410CKO。

3.根據權利要求2所述的利用CRISPR技術構建miR-379/410基因簇條件性敲除模型的方法，其特征在于：

所述步驟4)為：利用Cas9蛋白、體外轉錄獲得的sgRNA、5’同源臂Donor、3’同源臂Donor，構建miR-379/410CKO。

4.根據權利要求3所述的利用CRISPR技術構建miR-379/410基因簇條件性敲除模型的方法，其特征在于，所述步驟2)為：

針對miR-379上游，設計5’arm同源臂引物和3’arm同源臂引物，以小鼠基因組DNA為模板，通過PCR的方法，從小鼠基因組中擴增出帶有lox P的5’arm片段和帶有lox P的3’arm片段；然后通過SILAC的方法將5’Donor的5’arm片段、3’arm片段和線性化的pMD-18T片段連接，獲得5’donor重組質粒。

5.根據權利要求2～4任一所述的利用CRISPR技術構建miR-379/410基因簇條件性敲除模型的方法，其特征在于：

受體鼠出生的F0代小仔，提取基因組DNA進行PCR和測序鑒定，確認基因型；

當采用引物①進行PCR：當PCR產物為322bp時，為WT小鼠；當PCR產物有414bp和322bp兩條帶時，此為miR-379/410CKO雜合子小鼠；當PCR產物是單一的414bp時，此為miR-379/410CKO純合子小鼠；

當采用引物②進行PCR：當PCR擴增不出任何條帶時，為WT小鼠；當PCR產物是323bp時，此為miR-379/410CKO雜合子小鼠或者miR-379/410CKO純合子小鼠。