[發(fā)明專利]獲得穩(wěn)定核小體定位信息的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110986774.6
• 申請日: 2021-08-26
• 公開（公告）號: CN113564237A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設計）人: 叢斌;董春楠;王琳;李淑瑾;馬春玲
• 申請（專利權）人: 河北醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡耸聞账邢薰?13112
• 代理人: 張莉靜

本發(fā)明提供了一種獲得穩(wěn)定核小體定位信息的方法，其包括以下步驟：（a）對待檢測樣本進行預處理，獲得包含DNA的樣品；（b）將樣品分組，分別用高、中、低劑量水平的微球菌核酸酶對相應樣品進行消化；（c）使用試劑盒提取消化后樣品中的DNA，獲得核小體核心區(qū)DNA；（d）對獲得的核小體核心區(qū)DNA進行測序，將相同微球菌核酸酶消化水平的兩個樣本數(shù)據(jù)使用生物信息學工具DANPOS進行比較，進而篩選出穩(wěn)定核小體定位信息。本發(fā)明提供了一種獲得穩(wěn)定核小體定位信息的方法，本發(fā)明的穩(wěn)定核小體指在不同樣本間定位一致的核小體，其對于法醫(yī)鑒定來說可靠性更高。

技術領域

本發(fā)明涉及法醫(yī)鑒定技術領域，具體地說是一種獲得穩(wěn)定核小體定位信息的方法。

背景技術

法醫(yī)檢案過程中經(jīng)常會遇到各種各樣的降解生物檢材。在細胞死亡后，生物檢材同時受到高溫、潮濕、土壤微生物、暴曬、強酸、強堿和紫外輻射等因素的作用，使DNA發(fā)生降解。在這種情況下，后續(xù)實驗過程中常常會有PCR擴增缺失或錯誤擴增，STR分型出現(xiàn)Ladder-like條帶、Sutter峰、等位基因不平等擴增及丟失等現(xiàn)象，使DNA分型成功率大大降低，案件偵破變得極為困難。為解決降解生物檢材分析這一難題，國內(nèi)外學者進行了大量深入研究，但仍然無法解決全部問題，使案件無法順利偵破。

核小體是真核生物染色質(zhì)最基本的結(jié)構單位，由DNA和組蛋白構成。每個核小體DNA長約200bp，其中纏繞在組蛋白八聚體上的核心DNA (core DNA)約146bp，兩個組蛋白八聚體間的DNA (linker DNA) 約20-50bp。Bjo ? rn Rydberg等在放射性輻射中觀察到活細胞中DNA鏈的核小體保護作用。另有研究發(fā)現(xiàn)在細胞凋亡或程序性細胞死亡過程中，核小體DNA序列能夠逃脫酶促反應的切割。核小體對核心DNA序列的這種保護作用能否應用于法醫(yī)降解生物檢材的檢測，目前已有法醫(yī)工作者進行了探索，但存在一定爭議。例如A. Freire-Aradas 等使用生物信息學軟件RECON篩選出核小體核心區(qū)18個SNPs，并構建復合擴增體系；該體系對降解檢材的分型成功率較SNP for ID 高6%，并且明顯高于miniSTR體系。Phuvadol Thanakiatkrai 等使用生物信息軟件NXSensor 和nuScore對60個STR位點的核小體定位情況進行評分，結(jié)果顯示這些STR基因座已經(jīng)在一定程度上受到了保護核小體降解。建議在選擇遺傳標記時盡量選擇可以受到保護的基因座。但該團隊后續(xù)進行的實驗驗證結(jié)果顯示不同評分STR位點間檢出率并無差異。

基于上述情況，我們認為出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是核小體定位方法的差異。目前仍然缺乏獲得精確核小體定位的方法，核小體定位方法分為兩類，軟件預測和實驗方法。國外團隊均是基于預測軟件對核小體核心區(qū)域進行定位。這種整體上屬于分類預測的方法并不是解決核小體定位問題的根本途徑。核小體形成時會受到多種因素影響，如二核苷酸周期性和堆積力，GC含量和染色質(zhì)重塑。有研究也表明細胞所處環(huán)境常較DNA序列信號更具影響力，從而導致核小體占據(jù)或離開某一位點。核小體預測軟件是基于DNA與組蛋白結(jié)合的形成能或序列信號特性開發(fā)而來，可能忽略了其它核小體形成因素。微球菌核酸酶消化結(jié)合高通量測序（MNase-seq）是最常用的核小體定位實驗方法，但是對數(shù)據(jù)庫中的各種物種的MNase-seq數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，即使是在相同的細胞系中，不同的數(shù)據(jù)之間單個核小體的位置也存在差異。造成差異的原因，一部分是核小體本身的動態(tài)性即核小體定位受染色質(zhì)重塑等過程的調(diào)控而變化，另一部分是由實驗方法和數(shù)據(jù)分析方法引起的噪音。這些情況為核小體的精確定位帶來了困擾。Daniel J. Gaffney等通過計算基因組200bp區(qū)域內(nèi)片段中點的集中程度來評估多個樣本在基因組上某個位置的核小體定位一致性。但是該方法并沒有考慮到測序產(chǎn)生的重復reads和不同樣本的測序深度差異，這些因素會影響穩(wěn)定核小體定位的精確度。因此，研究一種可獲得高精確度核小體定位的方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供一種獲得穩(wěn)定核小體定位信息的方法，以解決現(xiàn)有技術中核小體定位方法精確度低的問題。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種獲得穩(wěn)定核小體定位信息的方法，包括以下步驟：